本文要點：腦側(cè)支循環(huán)與血腦屏障（BBB）對維持正常腦功能至關(guān)重要，受限于現(xiàn)有方法對腦血流微小通路的記錄能力,，學界對生理和病理狀態(tài)下側(cè)支灌注與血腦屏障動態(tài)演變的認知仍顯不足,。本文報道了一種由小分子染料與牛血清白蛋白構(gòu)成的高結(jié)晶度半導體有機納米探針（命名為4T-BSA），其在第二近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）展現(xiàn)出顯著的活體腦血管成像潛力。該探針在完整小鼠腦中具有成像穿透深度，信背比（SBR）達6.0,，并能在三種典型shen經(jīng)的病理生理模型中實現(xiàn)低至50微米級的腦血管空間分辨率。通過可視化血管側(cè)支灌注與白蛋白滲漏,，4T-BSA納米探針精準識別了與動/靜脈側(cè)支血流網(wǎng)絡及血腦屏障破壞相關(guān)的腦病理活動,。本項研究，基于NIR-II成像的腦側(cè)支循環(huán)與血腦屏障損傷評估技術(shù),，將為神經(jīng)系統(tǒng)疾病及時干預,、神經(jīng)保護及功能修復等重大醫(yī)學挑戰(zhàn)提供廣闊解決方案。

全光譜小動物活體成像系統(tǒng)

本研究開發(fā)了一種高結(jié)晶度半導體有機NIR-II納米探針（命名為4T-BSA）,。該探針通過修飾CH1055分子的功能基團后,，與牛血清白蛋白（BSA）非共價組裝形成新型分子復合物。研究團隊在1350 nm窄波段（NIR-IIa區(qū)）開展了系統(tǒng)的體外與活體成像實驗,，并與傳統(tǒng)光學及磁共振成像技術(shù)進行對比,。實驗對象涵蓋腦動脈閉塞（MCAO）、腦靜脈竇血栓（CVST）及戊四氮點燃癲癇等典型shen經(jīng)的病理生理模型,。多維度證據(jù)表明,，4T-BSA納米探針能夠高保真記錄生理狀態(tài)下深部腦血管血流動力學特征及動靜脈側(cè)支循環(huán)響應（圖1a–c）。尤為重要的是,，得益于對血清白蛋白的高親和力,，該探針可在病理條件下（特別是血腦屏障早期滲漏階段）實現(xiàn)無創(chuàng)、精準,、實時的血腦屏障微滲漏動態(tài)追蹤（圖1d,e）,。

圖2. 4T-BSA納米探針的結(jié)構(gòu)和光學特性

將CH1055的四個羧酸基團全部替換為更具負電荷的磺酸基團（命名為4T），然后與牛血清白蛋白（BSA）組裝形成4T-BSA納米探針（圖2a）,。4T和4T-BSA納米探針的紫外-可見（UV–vis）光譜在320-1000 nm范圍內(nèi)顯示出相似的吸收信號,。如圖2b所示4T和BSA的自組裝在近紅外二區(qū)（NIR-II）成像系統(tǒng)下導致熒光強度顯著增加（圖2b插圖）。4T-BSA納米探針在≈990 nm處有最大熒光發(fā)射峰,，在808 nm激發(fā)下,，其發(fā)射強度比4T高出110倍以上,。在808 nm激發(fā)下，4T-BSA在990 nm處的量子產(chǎn)率計算為5.3%,。透射電子顯微鏡（TEM）圖像及其對應的粒徑分布直方圖（圖2c）清楚地表明,，4T-BSA納米探針具有膠體穩(wěn)定性，呈球形,，平均直徑為5.5±0.6 nm,。通過高分辨率透射電子顯微鏡（HR-TEM）仔細測量，在4T-BSA納米探針中可以直接觀察到發(fā)育良好的晶格邊緣,，其晶面間距約為0.25 nm（圖2d）,。元素分布的映射表明存在富含硫的黃色區(qū)域，表明小分子4T自組裝到BSA的內(nèi)部,。原子力顯微鏡（AFM）證實，4T-BSA納米探針在水中表現(xiàn)出優(yōu)異的單分散性,，主要直徑位于3-7 nm范圍內(nèi)（圖2f）,，與TEM分析一致。通過選擇從1150到1400 nm的連續(xù)長通濾波器,，發(fā)現(xiàn)腦血管在長達1350 nm的更長波長窗口處比在較短波長窗口處更清晰,，之后深層血管的信號開始減弱（圖2g）。對腦血管橫截面強度輪廓的進一步量化信噪比（SBR）測量表明,，在808 nm激發(fā)下,，NIR-II成像的最大分辨率在1350 nm長通濾波器（NIR-IIa窗口）（圖2h）。在之后的部分中,，除非另有說明,，否則成像在NIR-IIa窗口中進行。

圖3. 利用4T-BSA納米探針在不同小鼠模型中對腦血管進行高分辨率NIR-IIa熒光活體成像

為了探究近紅外二區(qū)（NIR-II）成像觀察腦循環(huán)系統(tǒng)病理生理過程的可行性,，分別將4T-BSA和吲哚青綠（ICG）-BSA納米探針以等效劑量（35 nM）通過靜脈注射到三種典型的shen經(jīng)的病理生理學小鼠模型中（每組3只）,。在808 nm激光照射下，通過完整的頭皮和頭骨,，在狹窄的1350-1650 nm成像區(qū)域內(nèi),，對小鼠腦的腦血管系統(tǒng)進行了大視場成像記錄。與ICG-BSA納米探針在NIR-I（<900 nm）區(qū)域中無法區(qū)分的血管和較低的信噪比（SBR）,。形成鮮明對比的是,，4T-BSA納米探針在NIR-IIa窗口中的腦血管熒光成像明顯顯示出更高的空間分辨率，無論是在哪種shen經(jīng)的病理生理學小鼠模型中,。在假NIR-IIa組（圖3a,、d）中，通過4T-BSA納米探針拍攝的腦血管造影清晰地顯示了大腦中動脈（MCA）,、下腦靜脈,、上矢狀竇（SSS）,、橫竇、竇匯,，以及頭皮和頭骨下的雙側(cè)大腦半球中的大量皮質(zhì)血管和腦微血管,。4T-BSA納米探針在NIR-IIa區(qū)域中SSS的信噪比（圖3d）計算為6.0±0.1，這明顯高于ICG-BSA在NIR-I窗口中的信噪比（1.7±0.2,；P<0.01）,。在NIR-IIa區(qū)域中成像的SSS的高斯擬合半高全寬（FWHM）估計為702±3.9 µm（圖3g），而通過ICG-BSA納米探針成像的SSS的FWHM增加到1105±8.2 µm,。此外,，左右大腦中動脈區(qū)域選定血管的FWHM分別為206±2.3和149±4.1 µm。

在大腦中動脈閉塞（MCAO）的NIR-IIa組中,，4T-BSA納米探針的NIR-II熒光信號在對側(cè)大腦半球的右側(cè)大腦中動脈（MCA）區(qū)域可以明顯觀察到（圖3b,、e），而在左側(cè)（同側(cè)）半球幾乎沒有信號（用白色虛線圈標出）,。右側(cè)MCA區(qū)域選定血管的橫截面強度輪廓的半高全寬（FWHM）被確定為197±7.1 µm,，而在左側(cè)的鏡像動脈上無法實現(xiàn)這一測量（圖3h），這表明MCA區(qū)域存在低灌注,。同樣,，在腦靜脈竇血栓形成（CVST）的NIR-IIa組中，4T-BSA納米探針可以照亮雙側(cè)大腦中動脈區(qū)域（圖3f）,。左側(cè)MCA區(qū)域選定血管的FWHM為129±5.2 µm,，信噪比（SBR）高達5.2±0.1（圖3i），而在上矢狀竇（SSS）區(qū)域幾乎沒有監(jiān)測到熒光信號,。因此,，NIR-IIa成像能夠準確定位CVST模型中的血栓位置。

圖4. 4T-BSA納米探針NIR-IIa活體成像定量分析不同shen經(jīng)的病理生理模型小鼠血流動力學腦灌注

為了研究局部腦血流,，研究人員分別通過尾靜脈注射將35 nM的4T-BSA納米探針注入假手術(shù)（sham）,、大腦中動脈閉塞（MCAO）和腦靜脈竇血栓形成（CVST）模型的C57BL/6小鼠體內(nèi)。通過時間序列的NIR-IIa成像（1350 nm長通濾波器,、808 nm激發(fā),，成像速率為每秒1幀）記錄信號波動，以研究無需開顱情況下腦部視野內(nèi)的信號變化,。在假手術(shù)NIR-IIa組中,，NIR-II熒光強度隨注射后時間的延長而迅速增加。如預期所示,，左側(cè)大腦中動脈（MCA）區(qū)域的NIR-IIa信號強度幾乎與相應的右側(cè)區(qū)域相等,，表明雙側(cè)MCA區(qū)域的灌注率相同。在MCAO組中,，4T-BSA納米探針的熒光信號（圖4b中綠色虛線圈標出）在注射后1秒內(nèi)立即出現(xiàn)在右側(cè)MCA（對側(cè)）區(qū)域,。值得注意的是,，右側(cè)MCA的熒光信號迅速增加，并在注射后約40秒達到平穩(wěn),，而左側(cè)MCA（同側(cè)）區(qū)域幾乎沒有NIR-IIa信號出現(xiàn)（圖4b中黃色虛線圈標出）,。動態(tài)熒光信號波動分析表明，大腦左側(cè)MCA區(qū)域的血流灌注顯著減少,。例如,，右側(cè)MCA區(qū)域的腦血流灌注率比相應的左側(cè)缺血MCA區(qū)域高出約五倍。此外,，在假手術(shù)組中,，矢狀竇（SSS）的前后區(qū)域的NIR-IIa信號沒有明顯差異。令人印象深刻的是,，在CVST組中,，4T-BSA納米探針注射后，SSS前區(qū)域（圖4c中黃色虛線圈）的NIR-IIa熒光信號可以立即觀察到,。同時,，SSS后區(qū)域（圖4c中綠色虛線圈）的NIR-IIa信號幾乎可以忽略不計，這代表了血栓形成的部位,。如圖4g總結(jié)所示，SSS前區(qū)域的腦血流灌注率比后區(qū)域高出約四倍,，表明由于SSS后區(qū)域的竇血栓（阻塞）導致靜脈回流障礙,。

圖5. 在體實時記錄腦內(nèi)動脈或靜脈側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡的演變

研究人員探討了4T-BSA納米探針在大型顱內(nèi)血管（大腦中動脈或矢狀竇）近端阻塞時，準確測量腦部微血管動靜脈側(cè)支循環(huán)的潛力,。將整個小鼠頭部放置在激光下的成像平臺上,，然后在通過尾靜脈向MCAO和CVST模型的C57BL/6小鼠體內(nèi)注射35 nM的4T-BSA納米探針后，連續(xù)記錄90分鐘,。

在MCAO組中,，在低倍率（2.5×）下實時捕捉整個小鼠頭部的動態(tài)圖像，可用于觀察整個小鼠頭部（圖5a）,。值得注意的是,，NIR-IIa動態(tài)圖像（40分鐘）中的藍色箭頭代表一種血管畸形，這由4T-BSA納米探針在腦血管中的明亮發(fā)射強度證實,。在放大左側(cè)大腦中動脈區(qū)域后,，通過NIR-IIa動態(tài)成像的高倍率（10×）監(jiān)測感興趣區(qū)域（圖5a中的藍色虛線矩形），以明確血流低灌注的細節(jié),。如圖所示,，在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘，明確觀察到單一毛細血管的血流灌注（圖5b中的白色箭頭）,。圖5b中藍色虛線穿過血流灌注區(qū)域的橫截面強度輪廓證實了在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘新生血管的出現(xiàn)（圖5d）,。這些新生血管的特征是尖銳的峰值,，半高全寬（FWHM）約為42微米。NIR-IIa血流灌注成像表明皮質(zhì)動脈側(cè)支循環(huán)的開通,，這可以支持大腦組織在阻塞的左側(cè)大腦中動脈區(qū)域的存活（圖5c）,。同時，4T-BSA納米探針的流動可用于評估與動脈側(cè)支循環(huán)相關(guān)的血流灌注動態(tài)（圖5e）,?；贛CAO模型大腦中動脈側(cè)支循環(huán)血流網(wǎng)絡演變的上述血流灌注研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)在動脈側(cè)支循環(huán)的最大開通至少維持了65分鐘（圖5e）,，從而在急性缺血性疾病期間確保足夠的血流以支持大腦的存活,。

在CVST模型中，可以輕松測量靜脈竇阻塞部位周圍的腦靜脈側(cè)支循環(huán)灌注（圖5f）,。仔細觀察在注射4T-BSA納米探針后30分鐘內(nèi)的連續(xù)放大NIR-IIa圖像,，清楚地檢測到在阻塞的靜脈竇區(qū)域上方有許多復雜側(cè)支吻合發(fā)育（圖5g）。此外,，發(fā)現(xiàn)多個側(cè)支連接從血栓周圍的腦血管（矢狀竇的中后區(qū)域）移動到矢狀竇的前區(qū)域（圖5g中的白色和藍色箭頭）,。綜合來看，4T-BSA納米探針的NIR-IIa成像可以闡明側(cè)支血流灌注的高分辨率連續(xù)實時監(jiān)測,。對相同血管和吻合區(qū)域的橫截面強度輪廓進行定量分析,，進一步證實了阻塞靜脈竇區(qū)域周圍的腦靜脈側(cè)支循環(huán)灌注（圖5h）。

參考文獻

Chen S, Chen H, Li X, et al. Dynamic Pathophysiological Insight into the Brain by NIR‐II Imaging[J]. Advanced Science, 2025: 2416390.

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