牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）如何操作

【產(chǎn)品名稱】 

通用名稱：牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：Lumpy skin disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測(cè)LSDV,，對(duì)LSDV引起的牛的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)LSDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含LSDV基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào),。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

      注：陰性對(duì)照為滅菌純水，陽(yáng)性對(duì)照為含牛結(jié)節(jié)性皮膚病靶基因的質(zhì)粒,。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler 480,、西安天隆系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.　樣品采集及處理

1.1　患畜液體樣品：無菌采集抗凝血或血清,、精液或細(xì)胞懸浮液5 mL。   

1.2　患畜組織樣品：包括皮膚,、肺,、脾臟、淋巴結(jié),、肌肉等組織樣品,。2~8℃低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)。

2.　樣品處理方法

2.1　組織樣品：包括皮膚,、肺,、脾臟、淋巴結(jié),、肌肉等,。取2g-5g組織樣品切成小塊，加入5ml-10ml預(yù)冷的PBS緩沖液勻漿2min,，制成懸液,，反復(fù)凍融3次，4℃ 5000r/m離心10min,，取上清液待檢,；

2.2　液體樣品：抗凝血樣品置離心管中,，掌上離心機(jī)離心2 分鐘取上層血漿，待檢,。非抗凝血樣品置離心管中,，待凝固后，掌上離心機(jī)離心2 分鐘取上層血清,，待檢,。

2.3  標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長(zhǎng)期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃；

標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

 4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長(zhǎng)期,。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,，對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%,。

【注意事項(xiàng)】

1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理,；

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè),；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,；

3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用,，以免污染,；檢測(cè)結(jié)束后，應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)清潔,；

4. 吸取反應(yīng)液時(shí),，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心,；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放,；

7. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；

8. 檢測(cè)過程中使用過的吸頭,，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測(cè)結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒,；

9.儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用,。