細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)操作,，其目的是將細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)板上,，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。下面為你介紹詳細(xì)操作流程：

1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

材料：細(xì)胞懸液,、培養(yǎng)基、胰酶,、PBS 緩沖液,、血清、96 孔板或 24 孔板等培養(yǎng)板,。

器材：移液器及配套槍頭,、離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱,、超凈工作臺,、倒置顯微鏡。

試劑配制：提前配制好含 10% 血清的培養(yǎng)基,，若細(xì)胞貼壁性差,，還需用多聚賴氨酸對培養(yǎng)板進(jìn)行包被處理,，即將適量多聚賴氨酸溶液加入培養(yǎng)板各孔，室溫孵育 1-2 小時,，吸去溶液,，用 PBS 沖洗 2-3 次，晾干備用,。

2.細(xì)胞懸液制備

取出細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中取出長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶,，在超凈工作臺內(nèi)，用移液器吸去瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基,。

清洗細(xì)胞：向瓶內(nèi)加入適量 PBS 緩沖液,，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，潤洗細(xì)胞 1-2 次,，以去除殘留培養(yǎng)基及雜質(zhì),，吸去 PBS。

消化細(xì)胞：加入適量胰酶溶液,，覆蓋細(xì)胞層,，將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓,、脫離瓶壁時,，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。血清中的蛋白可中和胰酶活性,，防止過度消化,。

吹打細(xì)胞：用移液器反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞層，使細(xì)胞全部分散成單細(xì)胞懸液,。吹打過程要控制力度,，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細(xì)胞。

離心收集：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管,，以 1000-1500 轉(zhuǎn) / 分鐘的速度離心 3-5 分鐘,，使細(xì)胞沉淀在管底。

重懸細(xì)胞：吸去上清液,，加入適量新鮮培養(yǎng)基,，用移液器輕柔吹打，將細(xì)胞重懸,，制成均勻的細(xì)胞懸液,。

3.細(xì)胞計(jì)數(shù)

稀釋細(xì)胞懸液：取少量細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基按 1:1 或 1:2 的比例稀釋,，避免細(xì)胞濃度過高難以計(jì)數(shù),。

加載細(xì)胞懸液：將稀釋后的細(xì)胞懸液滴加在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)，注意不要產(chǎn)生氣泡,，蓋上蓋玻片,。

計(jì)數(shù)細(xì)胞：在顯微鏡下,，計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板四個大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。壓線細(xì)胞遵循 “計(jì)上不計(jì)下,，計(jì)左不計(jì)右” 原則,，避免重復(fù)計(jì)數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞濃度：細(xì)胞濃度（個 /mL）=（四個大格細(xì)胞總數(shù) / 4）× 稀釋倍數(shù) ×10^4 ,。

4.細(xì)胞鋪板

計(jì)算鋪板體積：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和培養(yǎng)板規(guī)格,，確定每孔所需細(xì)胞數(shù)量。如 96 孔板每孔一般接種 5×10^3 - 2×10^4 個細(xì)胞,，24 孔板每孔接種 5×10^4 - 2×10^5 個細(xì)胞,。根據(jù)細(xì)胞濃度計(jì)算所需細(xì)胞懸液體積，如細(xì)胞濃度為 1×10^5 個 /mL,，96 孔板每孔需接種 1×10^4 個細(xì)胞,，則每孔需加入細(xì)胞懸液體積為 100μL。

鋪板操作：用移液器吸取計(jì)算好體積的細(xì)胞懸液,，加入培養(yǎng)板相應(yīng)孔中,。從培養(yǎng)板一側(cè)邊緣開始，逐孔加入,，避免液體濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣過程中,，若需接種多塊板,，應(yīng)保持移液器操作一致，確保每孔細(xì)胞數(shù)量均勻,。

輕柔混勻：加樣完成后,，將培養(yǎng)板在水平桌面上輕輕晃動，或使用平板振蕩器,，低速振蕩 1-2 分鐘,，使細(xì)胞在孔內(nèi)均勻分布。注意振蕩幅度不宜過大,，以免細(xì)胞聚集,。

5.培養(yǎng)觀察

放入培養(yǎng)箱：將鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板放入 37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。CO?可維持培養(yǎng)基 pH 值穩(wěn)定,。

定期觀察：培養(yǎng) 2-4 小時后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及分布情況,。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布不均,，可輕微調(diào)整培養(yǎng)板位置，繼續(xù)培養(yǎng),。后續(xù)每天定時觀察細(xì)胞生長狀態(tài),，包括細(xì)胞形態(tài),、密度等，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備,。

細(xì)胞鋪板過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則,，動作輕柔，確保細(xì)胞活性及分布均勻性,，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行,。

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