1.前言

在分子克隆實(shí)驗中,，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是基因克隆的基礎(chǔ)步驟之一。但相信很多同學(xué)在涂板后,，常常會出現(xiàn)平板上菌落稀少甚至“空空如也”的尷尬局面,，這不僅耽誤我們的實(shí)驗進(jìn)度，還會消耗寶貴的試劑和時間,。實(shí)驗為何會卡在這一步,？本篇文章，將從幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手,，一起和大家好好探討一下這個問題,。

2.感受態(tài)細(xì)胞“不給力”

感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率直接決定了實(shí)驗成敗,。如果細(xì)胞本身質(zhì)量不佳，后續(xù)操作再完好也無濟(jì)于事,。例如感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)常反復(fù)凍融或長期儲存（超過6個月）,，則很有可能會導(dǎo)致其活性顯著下降。

感受態(tài)細(xì)胞是非常脆弱的，一些操作上的失誤同樣會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率,，凍融過程中如果未將細(xì)胞置于冰上,，則可能會破壞細(xì)胞膜的脆弱結(jié)構(gòu),；解凍后若未及時使用（如放置超過10分鐘），細(xì)胞活性會快速下降,；加入質(zhì)粒后劇烈吹打也會破壞細(xì)胞膜,，進(jìn)一步降低轉(zhuǎn)化成功率。正確的操作應(yīng)該是：凍融時需全程冰上操作,，解凍后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng),，質(zhì)粒加入后僅需輕彈混勻。

3 質(zhì)?！坝昧俊辈划?dāng)或與宿主菌不兼容

質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化成功的核心,，但它的用量常被忽視。在感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗中,，質(zhì)粒的用量需通過質(zhì)量（ng） 而非體積（μL）去控制,。

若僅依賴體積添加，就可能會因為質(zhì)粒濃度差異導(dǎo)致實(shí)際用量超出合理范圍（通常建議是 50-100 ng）,，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化效率,。我們可以利用分光光度計測量質(zhì)粒濃度，再依照公式：體積（μL）= 目標(biāo)質(zhì)量（ng） / 質(zhì)粒濃度（ng/μL）,，計算出所需添加的體積,。

某些質(zhì)粒需要特定宿主菌才能正常復(fù)制或表達(dá)。例如pET系列質(zhì)粒需使用BL21(DE3)菌株表達(dá)蛋白,，因為該菌株通過λ噬菌體DE3溶源整合,，染色體攜帶T7 RNA聚合酶基因，可驅(qū)動pET質(zhì)粒的T7啟動子轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因,。若質(zhì)粒與宿主菌的復(fù)制起點(diǎn)不兼容不匹配,，則可能導(dǎo)致質(zhì)粒無法復(fù)制，轉(zhuǎn)化后無菌落,。

4 熱激條件不“精準(zhǔn)”

熱激是感受態(tài)細(xì)胞吸收質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟,，其溫度、時間和操作順序需嚴(yán)格控制,。若條件不精準(zhǔn),，可能導(dǎo)致質(zhì)粒無法有效進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞膜修復(fù)過快，影響轉(zhuǎn)化效率,。熱激時間過短,，會導(dǎo)致無法充分打開細(xì)胞膜孔道；而熱激時間過長則可能損傷細(xì)胞,。

熱激完后,，我們還需要將細(xì)胞放在冰上冰浴一段時間，這一步的目的是修復(fù)細(xì)胞膜裂隙，避免細(xì)胞因膜結(jié)構(gòu)破損而死亡,。如果少了這一步,，就可能導(dǎo)致細(xì)胞膜無法閉合，轉(zhuǎn)化效率下降或細(xì)胞死亡,。

5 抗生素“過量”或“失效”

抗生素是篩選成功轉(zhuǎn)化的抗性菌落的關(guān)鍵,，但如果抗生素失效或濃度過高會直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化菌篩選失敗,。儲存不當(dāng)或過期的抗生素會失去抑菌活性，而濃度過高則會抑制目標(biāo)菌生長,。操作失誤,，如使用添加錯誤類型抗性平板，也會導(dǎo)致實(shí)驗失敗,。

6 涂板操作不“細(xì)致”

涂板是轉(zhuǎn)化的最后一步,，一些操作上的細(xì)節(jié)疏漏也可能導(dǎo)致前功盡棄。涂布量過多或過少會影響菌落密度與生長效率,，建議控制涂布量在10-50 μL,。菌液未充分混勻或涂布器未覆蓋整個平板表面，導(dǎo)致局部菌落過密或空白,。而如果使用涂布棒用力摩擦瓊脂表面，損傷細(xì)胞或菌液堆積,。

正確的操作應(yīng)該是：加入菌液后,，使用無菌涂布棒輕柔旋轉(zhuǎn)，充分分散菌液,；涂布后需靜置5分鐘,，待菌液被平板全部吸收后再倒置培養(yǎng)，防止冷凝水滴落污染菌落,。

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