在蛋白質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾,。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜,,使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜,而大分子被截留于膜表面,。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑,,而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力,。超濾濃縮的優(yōu)點是:操作條件溫和,無相變化,,對生物活性物質(zhì)沒有破壞,。
超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵,、超濾器,、透過液收集罐組成,料液經(jīng)泵打入超濾器,水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外,,被濃縮的料液在料液貯罐,、泵、及超濾器中循環(huán),。當料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進一步處理的濃縮料液,。
超濾應用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題:*,在超濾循環(huán)過程中,,由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用,,料液的溫度會逐漸升高,會造成蛋白質(zhì)分子的損失,。因此,,料液貯罐應加冷卻系統(tǒng),并安裝自動測溫及控制系統(tǒng),。第二,,某些酶的輔助因子散失為問題:一些酶含有輔助因子,其分子量小,,超濾時易從透過液中排除掉,,因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度,。其工作原理是:當溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時,,如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基,該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè),。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過孔而被帶走,。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來,洗脫液用于進一步的分離純化,。
4.泡沫分離
原理:將氣體通入含多種組分的溶液中,,由于這些組分的表面活性由差異,因此在溶液的表面,,某些組分將形成泡沫,,泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分,,故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同,。這樣,溶液中的組分舅得以分離,。
蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面,,這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過程是:蛋白質(zhì)從主體溶液中擴散到氣液界面,,該過程可能是可逆的也可能是不可逆的,;分子發(fā)生重排,,一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜,一種是稀膜,,另一種是濃膜,,可能會發(fā)生由多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的,。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性,、結(jié)構(gòu)和濃度。
泡沫分離的目的,,一方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/zui初溶液中蛋白質(zhì)濃度),另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/zui初的蛋白質(zhì)質(zhì)量),,或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)zui大,。
二、抽提 沉淀
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨,,其溶解度大,、價格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強,,其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來,。對酶沒有破壞作用。
pH的控制:應從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮,,在酶等電點時其溶解度zui小易沉淀,,但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差,因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值,。在操作中一旦確定*pH值后,,在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值,要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性,。在添加硫酸銨時要注意攪拌,,并注意硫酸銨的加入速度,一般是由少到多,,緩慢加入,,硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制:有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好,,可在常溫下進行鹽析操作,,而對于大多數(shù)酶,盡可能在低溫下操作,。
酶液的凈置:加完硫酸銨后,,酶液要靜置一段時間,使酶蛋白*沉淀下來,,酶靜置后,,就不要再加以攪拌,。
2.有機溶劑沉淀
有機溶劑選擇:可用于酶蛋白沉淀的有機溶劑包括醇類物質(zhì)等,如甲醇,、乙醇,、異丙醇。乙醇的親水性能較好,,可防止蛋白質(zhì)的變性,,酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉淀操作:有機溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性,,當溫度較高時變性蛋白質(zhì)分子就會變成*失活,。因此用有機溶劑處理時在0℃以下進行。用有機溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久,,要盡快加水溶解,。
3.聚合物絮凝劑沉淀 聚合物絮凝劑,如葡聚糖和聚乙二醇,,與酶分子爭奪水分子,,具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點是在水溶液中,,其濃度可達到50%,,濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作,,而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護作用,。聚乙二醇不會被吸附,故在離子交換吸附前不必去除,。
4.用金屬離子和絡合物沉淀
酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽,,其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與金屬離子相互作用后,,可逆變化較差,,尤其是用巰基衍生物,它結(jié)合的]金屬離子會催化酶變性而失活,。
5.用特殊試劑沉淀法
用鏈霉素可選擇性去除核酸,,從而使胞內(nèi)酶沉淀出來。鏈霉素鹽(濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì))對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好,,酶不易失活,。
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