有實驗室的地方，就不可避免的會出現(xiàn)實驗室污染,。實驗室的污染,，不僅會影響實驗與科研的質量和效果,還對實驗室工作人員的身體健康有損害，現(xiàn)在來一起了解下PCR實驗室的污染原因及解決方法,。             

一、PCR實驗室污染分類：

標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時,，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染,；標本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染,。

PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣槍、容器,、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染,。

PCR擴增產物污染：這是PCR反應中主要-常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性,。

還有一種容易忽視,，可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,，在操作時比較劇烈地搖動反應管,，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染,。

實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,，這個問題也比較常見，因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細胞內的質粒,，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大,。

二,、 污染監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染,。

對照試驗：

1,、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功,、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。

2、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照,。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,，進行PCR擴增,，以監(jiān)測試劑是否污染。

3,、重復性試驗,。

4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增,。

三,、防止污染的方法

進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程,，-大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn),。

劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管,，實現(xiàn)全閉管操作,，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行,，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行：

l 試劑準備區(qū),。

l 標本制備區(qū)。

l PCR擴增區(qū)及分析區(qū),。

切記：任何一間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū),。

分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在生物安全柜,、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

n PCR用水應為高壓的雙蒸水,；

n 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區(qū)配制；

n 引物和dNTP應分裝儲存,，分裝時應標明時間,，以備發(fā)生污染時查找原因。

四,、PCR實驗操作注意事項:

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：

1）. 戴一次性手套,，若不小心濺上反應液，立即更換手套,；

2）. 使用一次性吸頭,，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中,，避免氣溶膠的污染,；

3）. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況,，開蓋前稍離心收集液體于管底,。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面,；

4）. 操作多份樣品時,，制備反應混合液，先將dNTP,、緩沖液,、引物和酶混合好，然后分裝,，這樣即可以減少操作,，避免污染，又可以增加反應的精-確度,；

5）. 后加入反應模板,，加入后蓋緊反應管；

6）. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,，即可驗證PCR反應的可靠性,，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；

7）. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,，-好使用可替換或高壓處理的加樣器,。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該,，不能交叉使用,，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；

8）. 重復實驗,，驗證結果,，慎下結論。