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Nature 常客,？一文弄懂 LNP,，內(nèi)附制備 Protocol | MCE
脂質(zhì)納米顆粒，做藥物遞送的小伙伴一定不陌生,！遙想當(dāng)年,，小 M 也是看著同門拿著儀器擠膜，做表征,，來(lái)來(lái)回回……本期就給大家整理下關(guān)于脂質(zhì)納米顆粒那些事兒~
01
脂質(zhì)納米顆粒
LIPID NANOPARTICLES
脂質(zhì)納米顆粒 (Lipid Nanoparticle,，LNP) 是一種脂質(zhì)類物質(zhì)組成的納米粒子，具有均勻脂質(zhì)核心,，廣泛用于小分子和核酸藥物的遞送 (詳見(jiàn)往期：藥物如何遞送 ,？脂質(zhì)納米顆粒！),。
圖 1. 脂質(zhì)納米顆?；窘M成[1],。
脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：
• 低免疫原性,、具有良好的生物相容性和安全性
• 穩(wěn)定性強(qiáng)，在體內(nèi)不易變形
• 核酸包封率高
• 細(xì)胞穿透性強(qiáng),、轉(zhuǎn)染效率高
• 內(nèi)體逃逸能力強(qiáng)
02
如何制備,？
HOW TO PREPARE?
脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 的制備依賴于自組裝的能力，帶負(fù)電荷的核酸和帶正電荷的脂質(zhì)之間產(chǎn)生靜電絡(luò)合，LNP 通過(guò)脂質(zhì)組分之間的疏水作用和范德華作用相互生長(zhǎng),。
LNP 的制備可以通過(guò)多種方式進(jìn)行,，例如脂質(zhì)囊泡的擠出、脂質(zhì)膜的再水化,、納米沉淀,、微流體混合，一般的制備方式是將水和脂質(zhì)成分快速混合,。小 M 為大家整理了高分文獻(xiàn)中常用的制備方案,，大家可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行脂質(zhì)搭配比例上的調(diào)整~
• 天平稱取 15 mg DLin-MC3-DMA (MC3)，然后加入 200 μL 純乙醇溶解 MC3,，使其濃度達(dá)到 75 mg/mL;
mRNA 包載物
mRNA 應(yīng)溶解在 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液 (10 mM,，pH 4) 中，將上述步驟中得到的脂質(zhì)混合溶液與含有 mRNA 的水性緩沖液快速混合以實(shí)現(xiàn) 40/1 (總脂質(zhì)/mRNA,，wt/wt) 的最終重量比,。
注：mRNA 比例可以增加以降低潛在的脂質(zhì)毒性
mRNA –LNP 的制備
有三種常用的方法可以實(shí)現(xiàn)混合脂質(zhì)溶液和 mRNA 溶液的快速混合：移液管混合法 (小規(guī)模制備)、渦旋混合法 (中等規(guī)模制備) 和微流體混合法 (大規(guī)模制備) ,。
1. 將 16.8 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中,；
2. 向試管中加入 1.2 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II,；
3. 取另一個(gè)不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管,，加入 46 μL 檸檬酸緩沖液 (10 mM，pH 4),，向試管中加入 8 μL mRNA (1.0 mg/mL),，混合均勻;
4. 取 54 μL mRNA 緩沖液 加入步驟 2 中獲得的混合溶液 II，立刻吹打混勻 20-30s (手動(dòng)混勻);
注：水：乙醇的體積比為 3:1,，混合后立即吹打混勻,。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活性,。
5. 將步驟 4 得到的溶液在室溫下孵育 15 min；
6. 使用透析管 (MWCO 3500) 在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上,，以除去乙醇和酸性緩沖液,；
7. 透析后，將溶液轉(zhuǎn)至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中,，測(cè)量體積;
8. 加入 1 x PBS 溶液,，使總體積達(dá)到 800 μL。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存,。
1. 將 21 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中,；
2. 向試管中加入 9 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II,；
3. 取另一個(gè)不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管,，加入 80 μL 檸檬酸鹽緩沖液 (10 mM，pH 4),，向試管中加入10 μL mRNA (1.0 mg/mL),，混合均勻;
4. 將渦旋混合器設(shè)備設(shè)置為“ON”，速度水平設(shè)置為“1”;
5. 在渦旋混合器上以中速渦旋 mRNA 緩沖液,，再移取 30 μL 混合溶液 II 快速加入渦旋溶液中，將所得混合溶液渦旋 20-30 S;
注：水：乙醇的體積比為 3:1,，混合后立即吹打混勻,。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活
6. 將步驟 5 所得溶液在室溫下孵育 15 min;
7. 使用透析管（MWCO 3500) 在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上，以除去乙醇和酸性緩沖液;
8. 透析后,，將溶液轉(zhuǎn)至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中,，測(cè)量體積;
9. 加入 1 x PBS 溶液，使總體積達(dá)到 1000 μL,。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存,。
具體操作方案使用儀器相關(guān)度很高，建議參考具體使用的儀器步驟進(jìn)行,。
03
LNP 的表征
Characterization of LNPs
為了確保 LNP 的質(zhì)量和有效性,，需要對(duì) LNP 進(jìn)行參數(shù)表征，例如尺寸,、PDI,、電荷、RNA EE,。
• Zeta (平均直徑/粒徑): 通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 檢測(cè),。
• PDI (Polydispersity index, 多分散指數(shù)) ：范圍 0-1，數(shù)值越高表示多分散性越強(qiáng),，數(shù)值越小表示粒度越均勻,，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 檢測(cè)。
• Charge (電荷)：對(duì)于基于 RNA 的 LNP，通常優(yōu)選近中性電荷,，通過(guò) ζ 電位分析儀測(cè)量,。
• Morphology (形態(tài))：通過(guò)電子顯微鏡 (TEM、Cyro-EM,、SEM,、AFM 等) 檢測(cè)。
• RNA EE (RNA Encapsulation Efficieney%, RNA 包封效率) ：可通過(guò) Ribogreen 測(cè)定來(lái)測(cè)量,，先測(cè)定 LNP 外的 RNA 濃度,，然后使用表面活性劑溶解 LNP 來(lái)測(cè)量 LNP 內(nèi)部和外部的總 RNA 濃度，計(jì)算公式如下：
圖 2. LNP 的表征參數(shù)與相關(guān)檢測(cè)儀器[10],。
04
脂質(zhì)納米顆粒的發(fā)展
DEVELOPMENT OF LIPID NANOPARTICLES
LNP 是目前臨床應(yīng)用上最-廣泛的核酸藥物遞送載體,，目前已有近 80 種基于 LNP 為遞送載體的基因藥物進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段，大大加速了基因治療的發(fā)展[10],。但是,，LNP 在實(shí)際應(yīng)用中仍存在許多問(wèn)題，其一是因?yàn)?LNP 在經(jīng)過(guò)體循環(huán)后通常在肝部富集,，對(duì)其他給藥器官的靶向困難[11],。其二是 LNP 只能作為載體參與藥物遞送，無(wú)法協(xié)同 mRNA 治療,。
目前針對(duì) LNP 體系的改良都和這兩個(gè)方向有關(guān),。包括通過(guò)對(duì) LNP 基本四組分的改造與優(yōu)化增加 mRNA 遞送效率并提高安全性，或者通過(guò)引入第五組分來(lái)改善肝外靶向遞送[12],。
另外一種主流的優(yōu)化方案是通過(guò)引入帶修飾的脂質(zhì)原料,，對(duì) LNP 表面改性實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向。例如上面提到過(guò)的,，使用馬來(lái)酰胺化 PEG 脂質(zhì),，與蛋白\抗體相連接，實(shí)現(xiàn)靶向組織,、器官或細(xì)胞,。
后續(xù)我們會(huì)出一期推文整理不同的修飾基團(tuán)在其中的作用，以及如何設(shè)計(jì) LNP 感興趣的老師可以繼續(xù)關(guān)注~
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Cholesterol (HY-N0322) 是一種哺乳動(dòng)物中的主要固醇,，占質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成分的 20-25％,。 |
DSPE-PEG 2000 (HY-142979) 是一種含有 DSPE 和胺端末基的 PEG 聚合物。DSPE-PEG 2000 可用于形成膠束作為藥物遞送的納米顆粒,。 |
Lipid 5 (HY-138171) 是一種氨基脂質(zhì),，可在嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中提供有效的 mRNA 遞送。 |
DOPG sodium (HY-141571) 是一種天然存在的陰離子磷脂,，可以在水溶液中形成脂質(zhì)雙層,，并用于生成膠束,、脂質(zhì)體和其他人工膜。 |
OptiLNP RNA 轉(zhuǎn)染試劑 (肺部靶向) (HY-K2025) 是一種基于脂質(zhì)納米粒 (LNP) 技術(shù)開(kāi)發(fā)的即用型轉(zhuǎn)染試劑,，適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 mRNA 和短鏈 RNA 通過(guò)靜脈注射給藥的肺部靶向遞送,。 |
OptiLNP RNA 轉(zhuǎn)染試劑 (干細(xì)胞) (HY-K2019) 是一種基于脂質(zhì)納米粒 (LNP) 技術(shù)開(kāi)發(fā)的即用型轉(zhuǎn)染試劑，適用于不同類型的 RNA 在免疫細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染,。 |
Firefly luciferase mRNA-LNP (HY-153229) 是一種已包裹 Firefly luciferase mRNA 的脂質(zhì)納米粒 (LNP),，適用于 RNA 傳遞、翻譯效率,、細(xì)胞活力等檢測(cè),。 |
參考文獻(xiàn)：
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