百歐博偉生物：本文介紹了微生物實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)菌的驗(yàn)收、制備,、保藏,、 傳代、使用,、銷毀的管理規(guī)程,。規(guī)定了質(zhì)量管理部門實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌種的驗(yàn)收、制備,、儲(chǔ)管,、使用、以及銷毀等的相關(guān)規(guī)定,。適用于微生物限度檢查,、無(wú)菌檢查、抗生素微生物（效價(jià)）測(cè)定,、評(píng)價(jià)防腐劑和抗菌劑的抑菌效果和確認(rèn)滅菌效果,、檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證、培養(yǎng)基的適用性檢查,，樣品檢驗(yàn)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照等,。

1、標(biāo)準(zhǔn)菌的來(lái)源

標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷凍干燥菌種（0代）或由上級(jí)藥檢部門已接種好的菌種斜面（3代）,。黑曲霉的0代菌種為保存于含15%甘油的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管,。中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽CMCC（B）代表細(xì)菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每種菌具有固定的代號(hào)。

2,、標(biāo)準(zhǔn)菌的驗(yàn)收

從菌種保藏中心購(gòu)買的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌,，接收同時(shí)應(yīng)檢查是否有隨菌種附有的相關(guān)資料,。接收菌種時(shí)應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱，和每一支安瓿的完整性,。在相應(yīng)的菌種接收記錄上記上所有的關(guān)于菌種的信息,，如名稱、數(shù)量和接收日期等,。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標(biāo)簽,，內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào),、代次,、接收日期、接收人,、貯存條件,、有效期至。新購(gòu)入的0代原始菌種儲(chǔ)存于－20℃,，有效期為三年,。從上級(jí)藥檢部門購(gòu)買的已接種好的菌種斜面（3代）應(yīng)檢查菌種管是否完好。儲(chǔ)存于2～ 8 ℃,，有效期為3個(gè)月,。

3、標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇,、復(fù)壯及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的制備

3.1物品及試劑：接種針,、酒精燈、移液管,、75%酒精及75%酒精棉球

3.2培養(yǎng)基

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復(fù)蘇,、復(fù)壯。

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復(fù)蘇,、復(fù)壯,。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,、大腸埃希菌,、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌,、銅綠假單胞菌復(fù)蘇,、復(fù)壯。

改良馬丁培養(yǎng)基:用于白色念珠菌復(fù)蘇,、復(fù)壯,。

3.3操作步驟：

a.打開潔凈工作臺(tái)。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。

c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線,，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時(shí)必須小心,，因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂）。

d.以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中,。

e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并溶解,。

f.用無(wú)菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。

g.根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度30～35℃,，培養(yǎng)18～24小時(shí),；真菌培養(yǎng)溫度23～28℃,，培養(yǎng)3～5天。觀察是否渾濁,，渾濁說(shuō)明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng),；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天,，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理,。

h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻,，置23～28℃培養(yǎng)5～7天,，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一,，不應(yīng)有雜色,，斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色,。確認(rèn)后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到無(wú)菌試管中,。

i.取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按g項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無(wú)菌甘油混勻,，1-2ml/管分裝于凍存管,。每個(gè)菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào),，支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制,，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管,。黑曲霉的h項(xiàng)下洗脫液按h項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯,，制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入20ml ,、30%的無(wú)菌甘油混勻,，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支,，按順序進(jìn)行編號(hào),，支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制,，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管,。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽,。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào),、編號(hào),、代次、制備日期,、制備人,、貯存條件、有效期至等,。

j.儲(chǔ)備菌種管制備成功,，儲(chǔ)存于－20℃，有效期為三年,。

3.4菌種確認(rèn)

用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,，或相應(yīng)的宜于該細(xì)菌生長(zhǎng)的鑒別平板上，劃線分離出單個(gè)菌落,。然后在30～35℃下培養(yǎng)2～3天,；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在23～28℃下培養(yǎng)7天,；培養(yǎng)后,，觀察其菌落形態(tài)，應(yīng)符合該菌種形態(tài)特征,。

3.5污染處理

假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng),，則說(shuō)明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理,?？蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲(chǔ)備菌種管

3.6菌種的傳代與保藏

將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上,，每萌發(fā)一次即稱為一代,，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng),，即認(rèn)為已傳代一次,，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代,，直到第3代為工作菌種,。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代。

菌種的傳代保藏過(guò)程

3.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇為傳代，復(fù)壯為第二代,。 傳第三代時(shí)取1支凍存管自然解凍,，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí),，工作用菌種為第3代,。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3),，一類用于實(shí)驗(yàn)用（S3）,。

定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：

（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30分鐘,。

（2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期,，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺(tái)，打開紫外燈照射一小時(shí),。

（3）關(guān)閉紫外燈,。點(diǎn)燃酒精燈，左手握住菌種斜面,，將管口靠近火焰上方,，右手拿接種棒后端,，將接種環(huán)燒紅約30秒,，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)三次,。

（4）右手用無(wú)名指,、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼,，右手再輕輕拔開管塞,，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上,，刮取少量菌苔,，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方?！?/span>

（5）塞上管塞,，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支,，照上述操作打開管塞,，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線,，一直劃到斜面頂端,，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。

（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子,，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌,。

（7）將已接種好的細(xì)菌管置30～35℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天,。

當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)小于5時(shí),，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉(zhuǎn)接為（W4）,。按上述程序操作,，直至（W4）轉(zhuǎn)為（W5）為止，需重新接種,，舊的工作菌種進(jìn)行銷毀,。

菌種斜面的培養(yǎng)、保藏條件及時(shí)間

菌種            培養(yǎng)條件及時(shí)間      培養(yǎng)基             保存條件及時(shí)間

大腸埃希菌(CMCC(B)44102)         30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)     30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)       30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)       30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)   30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

生孢梭菌(CMCC(B)64941)           30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

白色念珠菌(CMCC(F)98001)         23～28℃ 最多7天    改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

黑曲霉(CMCC(F)98003)             23～28℃ 最多7天    改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

短小芽孢桿菌(CMCC(B)63602)       30～35℃22～ 24h    營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基     2℃～ 8 ℃保存3個(gè)月

注：菌種斜面1次/周觀察狀態(tài)是否正常,。

3.7菌種的使用及銷毀

每次進(jìn)行菌種復(fù)活時(shí),，只能復(fù)活一個(gè)菌種。如果要復(fù)活其他菌時(shí),，應(yīng)對(duì)所用物品重新消毒滅菌,。

每次操作，都應(yīng)進(jìn)行記錄,。菌種管上應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽,。標(biāo)明菌種名稱、菌種代號(hào),、代次,、傳代人、編號(hào)和傳代日期,、貯存條件,、有效期至等。

廢棄菌種及實(shí)驗(yàn)用品廢棄物的處理：121℃ 高壓蒸汽滅菌30分鐘,。并對(duì)操作過(guò)程進(jìn)行記錄,。

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