Keywords：原代肝細胞,；Primary Hepatocytes; 肝細胞分離；肝細胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol,；Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官,，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子,，既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】,，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑,。因此,，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞,。

一、原代肝細胞分離方法

肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取提取有直接剪切法,、組織塊培養(yǎng)法,、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等,。

【直接剪切法】

原理：將肝臟切成小塊,，然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化，分離得到肝細胞,。

優(yōu)點：操作簡單,，適用于大量細胞的分離。

缺點：細胞損傷較大,，純度較低,。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟切成小塊，在培養(yǎng)皿中加入含特定生長因子的培養(yǎng)液進行培養(yǎng),，使組織塊貼壁生長,，然后逐漸分離得到肝細胞。

優(yōu)點：能夠保持細胞的天然狀態(tài),，適用于長期培養(yǎng),。

缺點：操作較為繁瑣，細胞數(shù)量較少,。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化,，分離得到肝細胞。

優(yōu)點：能夠較為徹-底地分解細胞間物質(zhì),，獲得較純的肝細胞,。

缺點：胰蛋白酶的價格較貴，成本較高,。

【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中,，使肝實質(zhì)細胞與間質(zhì)分開，然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞,。

優(yōu)點：能夠保持細胞的天然狀態(tài),，適用于長期培養(yǎng)。

缺點：操作較為繁瑣,，細胞數(shù)量較少,。

【半原位膠原酶灌注法】

原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過門靜脈灌注膠原酶溶液,，使肝臟在生理狀態(tài)下進行消化,，然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞。

優(yōu)點：能夠較為真實地模擬生理狀態(tài),，獲得的細胞形態(tài),、活性較好。

缺點：操作較為復雜,，成本較高,。

其中,，兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小，肝細胞產(chǎn)率和存活率高,，成為了分離原代肝細胞的經(jīng)典方法,。

二、原代肝細胞分離流程

鑒于此,，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，在兩步膠原酶灌注的基礎上，開發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒,，有標準的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）,，其內(nèi)整合了包括灌流液、膠原酶,、細胞洗滌液、細胞純化液,、試驗耗材等在內(nèi)的所有組分,，可適用于大鼠、小鼠等多個種屬原代肝細胞的分離,。以下為詳細實驗流程：

1,、實驗材料

1)動物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機,、移液器,、生物安全柜

3)試劑：膠原酶、灌流溶液A,、灌流溶液B,、消化終止液、分離液添加劑,、肝細胞純化液

4)耗材：0.22um過濾器,、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器,、5ml無菌注射器,、無菌紗布、無菌剪刀,、無菌鑷子,、無菌燒杯、無菌擦手紙,、無菌50mL離心管及巴氏吸管

2,、試劑預處理

1)灌流溶液A：實驗前37℃水浴預熱30分鐘。

2)灌流溶液B：實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶,，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾,。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑，然后37℃水浴預熱30分鐘。

3)消化終止液：實驗前在無菌條件下,，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑,，混勻后置于冰上備用。

3,、實驗步驟及結(jié)果

(一)  肝臟獲取

1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進行全身消毒,，并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。

2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起,，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開,，以裸露腹部肌肉部位。

3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開,，使肝臟充分暴露,，注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破。

(二)  組織處理

1)用剪刀剪開圖A所示位置,，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔,，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A，將每葉肝臟都灌注至土黃色,。

2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B,，直至肝臟軟爛。

(三)  細胞獲取

1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀,，補加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌,。

3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液。

4)無菌紗布過濾即得肝細胞懸液,。

(四)  細胞洗滌

1)將肝細胞懸液輕輕顛倒混勻,，分裝至50mL離心管。

2)70g（升速 3,、降速 3）,、4℃離心 5min。

3)在超凈工作臺中棄上清,，消化終止液重懸細胞沉淀,。

(五)   細胞純化

1)按照 7：3 的比例（即細胞懸液：肝細胞純化液）加入肝細胞純化液并混勻。

2)100g（升速 3,、降速 3）,、4℃離心 10min。

3)棄上清,，使用凍存液將細胞重懸,，并于液氮罐中保存。

如圖所示,，該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細胞照片,，經(jīng)0.4%臺盼藍染色后發(fā)現(xiàn)細胞活率在90%以上,，且數(shù)量共有80million，說明以IPHASE原代肝細胞分離試劑盒為提取材料,，可獲得純度高,、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細胞！

三,、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，深刻識到原代肝細胞（Primary Hepatocytes）是構(gòu)建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞,。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎上研發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒,，在標準的肝細胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進行肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取,，并以SD大鼠為實例，證明該試劑盒,、該方法具有實用性,！除此以外，IPHASE以相似分離流程,，研發(fā)、生產(chǎn)了多種屬,、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細胞,，供客戶購買使用，為客戶縮短時間,，節(jié)約成本,！

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：

合規(guī)性：生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰,。

安全性：生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測,，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

高質(zhì)量：生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)控,，且同批次數(shù)量多,，批次間差異性小。

可定制：可根據(jù)客戶特殊需求,，提供特殊種屬肝細胞的定制服務,。

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產(chǎn)品，在國內(nèi)及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內(nèi)）,，并注明產(chǎn)品屬于我司所有,，即可申請獎勵。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同,，給予不同金額獎品：

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5分＜IF≤8分 800元禮品；

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IF≥10分 2000元禮品,；

我司標準信息如下

【中文簡稱】匯智和源

【中文全稱】匯智和源生物技術(shù)（蘇州）有限公司

【英文名稱】IPHASE Biosciences

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