構建重組蛋白屢次失敗的原因：分為以下幾點

一,、重組蛋白表達的原理

重組蛋白表達是利用DNA重組技術，將目標基因（外源基因）導入宿主細胞中,，并通過宿主細胞的生物機制使其表達出特定蛋白,。其主要步驟包括：

基因克?。簩⒛繕嘶蚪涍^PCR擴增后,，與表達載體連接，形成重組質粒,。

轉染或轉化：將重組質粒導入宿主細胞中,，可以使用化學方法、電穿孔或者嗜熱菌等方式進行轉染或轉化,。

表達蛋白：重組質粒進入宿主細胞后,，融合到宿主細胞的染色體中，隨后遵循細胞的轉錄和翻譯機制,，表達出目標蛋白,。

二、常見的重組蛋白表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)：大腸桿菌是常用的重組蛋白表達宿主細胞之一,。其優(yōu)點在于生長快速,、易于培養(yǎng)，并且能夠產生大量的蛋白,。此外,，大腸桿菌的遺傳工具和代謝途徑也被廣泛研究，提供了便利,。

酵母表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)包括釀酒酵母和畢赤酵母,。這些酵母細胞具有真核細胞的特點，能夠進行正確的蛋白折疊和修飾,。同時,，酵母細胞也可以進行大規(guī)模培養(yǎng)和高表達，適用于一些復雜蛋白的表達,。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)：昆蟲細胞表達系統(tǒng)常用于大規(guī)模蛋白表達,。昆蟲細胞具有真核細胞的優(yōu)勢，能夠對蛋白進行正確的折疊和修飾,，適合于表達大量需求復雜結構的重組蛋白,。

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)可用于高效表達復雜蛋白和進行蛋白質研究。哺乳動物細胞具有真核細胞特點,，能夠進行正確的蛋白質修飾和折疊,，并且在一些特殊情況下需要考慮到人類蛋白的免疫原性。

三,、重組蛋白生產步驟

細胞中有兩個蛋白生產階段：轉錄和翻譯,，被稱為分子生物學的中心法則。換言之,，轉錄和翻譯步驟屬于重組蛋白表達步驟,。

為了生產重組蛋白，基因被分離并克隆到表達載體中,。重組蛋白的生產需要蛋白表達系統(tǒng),、蛋白純化系統(tǒng)和蛋白識別系統(tǒng)。

獲取重組蛋白的基本步驟：

1.目標基因的擴增,。

2.插入克隆載體,。

3.亞克隆到表達載體中。

4.轉化到蛋白表達宿主中(細菌(大腸桿菌),、酵母細胞,、哺乳動物細胞或桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng))。

5.重組蛋白鑒定試驗(Western blot或熒光)

6.大規(guī)模生產,。(大規(guī)模發(fā)酵)

7.分離和純化,。