SEC分析中樣品吸附的改善:色譜柱的預(yù)處理
Wyeth BioPharma公司在一項(xiàng)方法優(yōu)化與研究中發(fā)現(xiàn),,在對(duì)從細(xì)胞培養(yǎng)原料中經(jīng)多步正交純化得到的表觀(guān)分子量為140 kDa的蛋白質(zhì)的各組分進(jìn)行SEC分析時(shí),使用BSA(牛血清白蛋白)對(duì)色譜柱進(jìn)行預(yù)處理,,顯著提高了重現(xiàn)性和回收率,。
Wyeth BioPharma在三步細(xì)胞培養(yǎng)純化的每個(gè)階段都會(huì)采用SEC分析,,以確定目標(biāo)蛋白中高分子量物質(zhì)的純度和回收率。細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)蛋白A親和層析以及后續(xù)的精制步驟進(jìn)行純化。在蛋白A洗脫后片段的SEC分析中,,高分子量物質(zhì)區(qū)域的洗脫峰回收率和重現(xiàn)性差異很大,,這表明樣品可能吸附在填料上。為了減少這種差異,,實(shí)施了用BSA進(jìn)行預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)方案,。
分析條件
色譜柱: TSKgel G3000SWXL(7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm)
流動(dòng)相: 磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)
樣 品: 進(jìn)樣量50 μL,進(jìn)液50 μg
檢 測(cè): UV@280 nm
進(jìn)樣量: 10 µL
結(jié)果與討論
如圖1所示,,蛋白A純化樣品在高分子量區(qū)域的回收率(%HMW)僅為1.1%。在向色譜柱中注入10份,、每份20 μL,、濃度為5 mg/mL的BSA后,回收率提高到了3.5%,。在未進(jìn)行BSA處理的情況下,,從以往的數(shù)據(jù)來(lái)看,使用新色譜柱時(shí)的蛋白A純化樣品的%HMW值為1.0%~1.4%,,而在進(jìn)樣多達(dá)60次后,,該值會(huì)逐漸上升至3.5%~4.0%。有趣的是,,這一結(jié)果僅在蛋白A純化樣品中表現(xiàn)明顯,。
圖1 BSA處理前后的蛋白A樣品的疊加圖
表1 BSA處理前后的全部三種樣品的回收率
樣品 | 處理前 % HMW | 處理后 % HMW |
蛋白A純化之后 | 1.1 | 3.4 |
精制層析步驟1之后 | 1.5 | 1.5 |
精制層析步驟2之后(最終產(chǎn)品) | 0.2 | 0.2 |
如表1所示,BSA預(yù)處理對(duì)從下游層析步驟中獲得的樣品沒(méi)有影響,。進(jìn)一步的表征分析表明,,與精制后的樣品相比,蛋白A純化樣品中存在較高水平的宿主細(xì)胞蛋白(HCP),。研究發(fā)現(xiàn),,這些HCP在SEC分析圖譜的HMW區(qū)域被洗脫出來(lái)。此外,,當(dāng)對(duì)BSA處理后的蛋白A純化樣品進(jìn)行SEC分析時(shí),,發(fā)現(xiàn)與BSA處理前對(duì)同一樣品進(jìn)行SEC分析時(shí)的結(jié)果相比,經(jīng)BSA處理后的樣品在HMW區(qū)域中的宿主細(xì)胞蛋白含量更高,。這表明,,樣品與色譜柱填料之間的相互作用在HCP上表現(xiàn)得最為普遍,而非目標(biāo)分子的HMW物質(zhì),。
研究結(jié)論
用BSA對(duì)SEC柱進(jìn)行預(yù)處理可以減少二次相互作用并提高分析間結(jié)果的一致性,。在這個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)方案中,與下游純化步驟(精制步驟1和步驟2)中HMW回收率未受影響的情況形成對(duì)比的是,,蛋白A純化組分在結(jié)果一致性方面有了顯著改善,,這為進(jìn)一步表征蛋白A純化樣品中的高分子量組分提供了契機(jī)。這一表征工作得出的結(jié)論是,對(duì)從早期純化步驟所得樣品進(jìn)行SEC分析的結(jié)果,,可能會(huì)受到源自細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的非產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的不利影響,。
參考文獻(xiàn)
1. Y. Kato et al; J. of Chromatrogr.404 (1987) 333-339
相關(guān)產(chǎn)品
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