富士膠片和光純藥株式會(huì)社 生物技術(shù)中心 福地大樹(shù)

◆前言

內(nèi)毒素,，是存在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的一種脂多糖（Lipopolysaccharide）,，僅需微量進(jìn)入血液便可引發(fā)發(fā)熱癥狀，大量存在時(shí)則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性,，甚至導(dǎo)致內(nèi)毒素休克和死亡^1）,。鑒于革蘭氏陰性菌在環(huán)境中的廣泛分布及其可能混入生產(chǎn)過(guò)程，加之內(nèi)毒素的耐熱性和不易滅活特性,，對(duì)注射劑和醫(yī)療器械實(shí)施內(nèi)毒素污染管理顯得尤為重要,。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)療,、疫苗,、抗體及核酸藥物等相關(guān)產(chǎn)品的蓬勃發(fā)展，內(nèi)毒素管理在這些產(chǎn)品中的重要性也日益凸顯,。

目前,，內(nèi)毒素的檢測(cè)主要依賴于利用鱟血細(xì)胞提取物凝固系統(tǒng)的鱟試劑（LAL/TAL）。然而,，為了保護(hù)鱟資源,、確保鱟試劑穩(wěn)定供應(yīng)、減少產(chǎn)品批間差異及提高檢測(cè)穩(wěn)定性,，各鱟試劑廠家正積極使用人工原料生產(chǎn)的基因重組蛋白來(lái)開(kāi)發(fā)重組鱟試劑（rLAL）,。

◆內(nèi)毒素測(cè)試法的檢測(cè)原理

內(nèi)毒素測(cè)試法是使用由鱟血細(xì)胞成分制備的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)或定量的方法。鱟的血細(xì)胞提取物成分中存在使內(nèi)毒素凝固的反應(yīng)體系,，這種凝固反應(yīng)基于多個(gè)絲氨酸蛋白酶前體依次活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖1）,。內(nèi)毒素激活鱟血細(xì)胞提取物中含有的C因子，隨后活化C因子激活B因子,。然后,，活化B因子再激活凝固酶前體，活化的凝固酶通過(guò)水解底物凝固蛋白原,，將其轉(zhuǎn)化為凝固素,，形成不溶性凝膠并凝固。在鱟血細(xì)胞提取成分中還存以G因子為起點(diǎn),，與β-葡聚糖發(fā)生反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),，該反應(yīng)也會(huì)引起凝固反應(yīng)。為實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素的特異性檢測(cè),，需去除G因子或抑制以G因子為起點(diǎn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),。

圖1 由內(nèi)毒素、β-葡聚糖引起的凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)

◆使用基因重組蛋白的重組鱟試劑（rLAL）試劑

目前已商業(yè)化的rLAL試劑有兩種,，一種是重組C因子試劑（rFC）,，僅使用參與內(nèi)毒素級(jí)聯(lián)反應(yīng)三因子中的C因子,；另一種是重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），使用與LAL試劑相同的3因子（C因子,、B因子,、凝固酶前體）。與rCR相比,，rFC的單次檢測(cè)成本低,，但是靈敏度較差，需要使用熒光底物的熒光檢測(cè)和檢測(cè)儀,。而rCR的靈敏度更高,，可發(fā)生顯色發(fā)應(yīng)，因此和天然鱟試劑一樣可使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),。近年來(lái),，有報(bào)告稱B因子對(duì)于內(nèi)毒素的特異性有著重要作用^2）3），因此使用含有C因子,、B因子和凝固酶前體的rCR來(lái)檢測(cè)內(nèi)毒素具有重要意義,。FUJIFILM Wako于2022年推出了rCR試劑PYROSTAR™ Neo。

◆PYROSTAR™ Neo的特點(diǎn)與改進(jìn)

PYROSTAR™ Neo是一款高靈敏度重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）,，可定量檢測(cè)低至 0.001 EU/mL的內(nèi)毒素,，且操作簡(jiǎn)單，只需將凍干粉末溶解于試驗(yàn)用水即可,，溶解后也具有優(yōu)異的穩(wěn)定性,。另一方面，由各研究機(jī)構(gòu)和鱟試劑廠家組成的重組鱟試劑共同研究小組在該產(chǎn)品上市后實(shí)施的評(píng)估結(jié)果表明,，PYROSTAR™ Neo在部分水樣中對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性低于天然鱟試劑⁴⁾,。由于生產(chǎn)用水占內(nèi)毒素檢測(cè)的比例較高，因此從安全角度來(lái)看,，對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性低有待改進(jìn)。針對(duì)這一問(wèn)題,，F(xiàn)UJIFILM Wako于2024 年 6月推出了PYROSTAR™ Neo+ 的改良版——PYROSTAR™ Neo＋,。

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◆PYROSTAR™ Neo＋

重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）PYROSTAR™ Neo＋，不僅繼承了前代PYROSTAR™ Neo的高靈敏度,、操作簡(jiǎn)便,、溶解后穩(wěn)定性優(yōu)異的特點(diǎn)，還提高了對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性（PYROSTAR™ Neo存在的問(wèn)題）,。通過(guò)對(duì)從日本全國(guó)各地采集的自來(lái)水樣品中的天然內(nèi)毒素進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試,，結(jié)果顯示，與PYROSTAR™ Neo相比,，PYROSTAR™ Neo＋的反應(yīng)性更高,，且與天然鱟試劑（ES-F）具有相同的反應(yīng)性（圖2）,。由于生產(chǎn)用水占內(nèi)毒素檢測(cè)的比例較高，從安全角度考慮,，PYROSTAR™ Neo＋對(duì)水中內(nèi)毒素的良好反應(yīng)性具有重要意義,。此外，PYROSTAR™ Neo＋另一大特點(diǎn)是在藥物檢測(cè)中,，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠,，并可檢測(cè)多種藥物。

圖2 對(duì)水中天然內(nèi)毒素反應(yīng)性的對(duì)比結(jié)果

◆結(jié)語(yǔ)

目前,，天然鱟試劑仍是內(nèi)毒素檢測(cè)的主流試劑,，而利用人工原料合成基因重組蛋白的重組鱟試劑的歷史較短，有待進(jìn)一步普及,。國(guó)際上主流藥典對(duì)使用重組鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的監(jiān)管情況如下：

· 2021年,，歐洲藥典正式收錄了利用熒光法的基因重組C因子試劑（rFC）。

· 第十八版（最新版）日本藥典的參考信息中記載了“使用基因重組蛋白作為內(nèi)毒素測(cè)試法和檢測(cè)試劑的替代法”,。

此外,，美國(guó)藥典將于2025年5月新增允許使用重組鱟試劑（rCR、rFC）進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的章節(jié),，因此重組鱟試劑備受關(guān)注,。這些發(fā)展可能會(huì)加速歐洲藥典追加收錄rCR，以及日本藥典對(duì)重組鱟試劑（rCR,、rFC）的正式收錄,。目前有關(guān)鱟試劑和重組鱟試劑的比較正在不斷推進(jìn)^4）5），今后可能會(huì)持續(xù)推進(jìn)重組鱟試劑的使用,，但需滿足制藥企業(yè)等用戶的具體需求以推動(dòng)重組鱟試劑的實(shí)際應(yīng)用,，從而實(shí)現(xiàn)用戶利益與環(huán)境保護(hù)（包括鱟類(lèi)生物保護(hù)）的平衡。?

參考文獻(xiàn)

1）棚元憲一：國(guó)立醫(yī)薬品食品衛(wèi)生研究所報(bào)告, 126, 19 (2008).

2）Kobayashi,Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya. M. : Int. J. Dev. Res. 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機(jī)器レギュラトリーサイエンス, 54 (4), 341 (2023).

5）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機(jī)器レギュラトリーサイエンス, 48 (4), 252 (2017).

◆產(chǎn)品列表

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