植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測(cè)定根系活力的方法,，為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù),。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚,，生成的三苯甲瓚比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化,，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體,，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。

操作步驟：

建議正式實(shí)驗(yàn)前選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,，了解本批樣品情況,，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi),！

1,、預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本制備

將根部組織洗凈，去除根上的泥土,，輕輕擦干,，不要過分?jǐn)D壓破壞根系細(xì)胞。

2,、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

① 臨用前取 10μL 10mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)液,，加入1990μL試劑二，充分混勻,，配制成 50μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液,，現(xiàn)用現(xiàn)配。（后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要1000μL,，為減小實(shí)驗(yàn)誤差,，故配制大體積。）

② 取 1mL 50 μg/mL TTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一支試劑三內(nèi)，充分震蕩混勻2min,?；靹蚝蠹尤?1mL 乙酸乙酯，再次充分震蕩混勻2min,，室溫靜置分層5min,，取上層溶液。

③ 將上層溶液用乙酸乙酯進(jìn)行稀釋,，得到20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用（吸取200μL 50μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可）,。

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)上機(jī)操作：

① 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至485nm,。

② 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定：取 200μL 20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))中，分別測(cè)定其在485nm處的吸光度,，分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管,、A空白管。計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管,。ΔA標(biāo)準(zhǔn)只需做1-2次,。

③ 操作表：

4、正式實(shí)驗(yàn)：

① 若樣品 37℃暗反應(yīng)未到4h但根系已出現(xiàn)深粉色,，此時(shí)可以直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作,；若ΔA測(cè)定大于1.5，可以減少樣本質(zhì)量或者縮短反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，計(jì)算公式注意修改,；

② 若4h暗反應(yīng)結(jié)束后，根系沒有出現(xiàn)粉色或者ΔA測(cè)定小于0.005,，可以延長暗反應(yīng)時(shí)間（8h,，16h甚至24h）或者加大樣品量，計(jì)算公式注意修改,。

③ 確定好最適實(shí)驗(yàn)條件后,，正式實(shí)驗(yàn)樣本制備同預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本制備；

④ 正式實(shí)驗(yàn)按照預(yù)實(shí)驗(yàn)上機(jī)操作步驟進(jìn)行（標(biāo)準(zhǔn)管和空白管預(yù)實(shí)驗(yàn)已做,，正式實(shí)驗(yàn)可選做）。

五,、結(jié)果計(jì)算：

按照樣本質(zhì)量計(jì)算根系活力：以TTC的還原量來表示根系活力：

TTC還原強(qiáng)度[ μg TTC/(g·h)] =ΔA測(cè)定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V÷(W×T)

=5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

W：根重,，g； C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,，20μg/mL,；

T：反應(yīng)時(shí)間，4h； V：試劑五的體積即勻漿體積,，1mL,。

注意事項(xiàng)：

1、試劑五容易揮發(fā),，有毒,，為了您的健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服,，戴口罩,，戴乳膠手套操作。

2,、如果離心后待測(cè)的上清依然渾濁,，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長時(shí)間，例如15000rpm 4℃離心 20min,。