Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis

Keywords: TNF‐α; articular cartilage breakdown; chondrogenic 3D model; immune cells; matrix degeneration; mesenchymal stromal cell; microfluidic system; pro‐inflammatory cytokine.

進(jìn)行性軟骨退化和軟骨下骨破壞是兩種主要關(guān)節(jié)疾病的標(biāo)志：骨關(guān)節(jié)炎（OA）和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）,。關(guān)節(jié)軟骨是一種富含細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的組織,，由 60%–80% 的水、20% 的蛋白聚糖/聚集蛋白聚糖,、5% 的 II 型膠原蛋白（Col）和 1%–5% 的軟骨細(xì)胞組成,。

壓縮應(yīng)力和剪切應(yīng)力是主要的機(jī)械應(yīng)力，如果它們過(guò)大會(huì)導(dǎo)致軟骨和關(guān)節(jié)功能障礙,、損傷和疼痛,。生理水平的壓縮和流體剪切應(yīng)力通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、ECM 產(chǎn)生,、生長(zhǎng)和分化對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生積極影響,。然而，這種機(jī)械應(yīng)力也會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響,，例如當(dāng)過(guò)度壓縮應(yīng)變時(shí)會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡和促炎因子的分泌,。此外，由于必要的機(jī)械應(yīng)力供應(yīng)不足,，低生理應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解,。

傳統(tǒng)的體內(nèi)模型難以分離和研究機(jī)械應(yīng)力對(duì)軟骨健康的具體影響。目前,，在臨床前研究中,，在體外 3D 人類(lèi)軟骨微結(jié)構(gòu)（CMCs）上模擬關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中機(jī)械應(yīng)力的微生理系統(tǒng)（MPSs）變得越來(lái)越重要。這些 3D CMCs 整合了細(xì)胞,、可溶性因子和 ECM 樣基質(zhì),，提供了細(xì)胞間相互作用和對(duì)基質(zhì)產(chǎn)生和降解的見(jiàn)解，以模擬關(guān)節(jié)軟骨,。

因此,，德國(guó)柏林夏里特醫(yī)院風(fēng)濕病學(xué)和臨床免疫學(xué)系、瑞士西北應(yīng)用科學(xué)與藝術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開(kāi)發(fā)了一種可施加剪切應(yīng)力的 MPS,，從而產(chǎn)生類(lèi)似于在體內(nèi)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)期間觀察到的生物反應(yīng),。該研究證明了生理剪切應(yīng)力保護(hù) CMC 免受 TNF-α介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的影響；另一方面，病理學(xué)上的低機(jī)械應(yīng)力使基質(zhì)沉積和再吸收的平衡在 TNF 處理后轉(zhuǎn)向分解代謝,，這種效果可以通過(guò) JAK 抑制來(lái)恢復(fù),。研究成果發(fā)表于 Advanced Science 期刊題為“Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis”。

首先,，使用低生理（0 Pa）與生理（0.2 Pa）力在 MPS 中將 CMC 暴露于流體剪切應(yīng)力,，檢測(cè)分析細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞活力和死亡沒(méi)有影響,，但細(xì)胞凋亡顯著減少（圖1 a-d）,。然后，分析了 ECM 標(biāo)志物 ACAN,、COL2A1,、COL1A1、COMP 和基質(zhì)降解酶MMP1,、MMP3 和 MMP13 的基因表達(dá),，觀察到 ACAN、COL2A1 的表達(dá)較高,，COL2A1 與 COL1A1 的比率較高,，但在 0.2 Pa 的流體剪切力下（對(duì)應(yīng)于生理力條件）下，COL1A1,、COMP 和 MMP13 的表達(dá)較低,，這表明軟骨形成增強(qiáng)，ECM 形成以及 ECM 降解減少（圖1 e）,。

在蛋白質(zhì)水平上,，CMCs 表現(xiàn)出更高的軟骨特異性 ECM 沉積物，例如 II 型膠原蛋白（COL2）和聚集蛋白聚糖（ACAN）,，而 I 型膠原蛋白（COL1）和基質(zhì)降解酶（MMP1 和 MMP13）在 0.2 Pa 的流體剪切應(yīng)力下表達(dá)較少（圖1 f）,。值得注意的是，促纖維化收縮肌動(dòng)蛋白亞型α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（αSMA）在 0.2 Pa 時(shí)表達(dá)較低,。有趣的是,，實(shí)驗(yàn)觀察到 CMCs 的內(nèi)、中,、外段對(duì)機(jī)械應(yīng)力的不同響應(yīng),。具體來(lái)說(shuō)，在生理剪切應(yīng)力下,，合成代謝軟骨形成 ECM 成分,，如 COL2 和 ACAN，在比較的外部部分主要表達(dá)較高,。相反,，與外部相比,，COL1 在內(nèi)部部分的表達(dá)更高。在生理剪切應(yīng)力下,，分解代謝 MMP1 和 MMP13 表達(dá)量保持不變，而在 0 Pa 的流體剪切應(yīng)力下表達(dá)較高,。值得注意的是,，促纖維化 αSMA 僅在 0 Pa 時(shí)表達(dá)較高。

這些結(jié)果表明,，在長(zhǎng)期生理剪切應(yīng)力條件下培養(yǎng) CMCs 會(huì)觸發(fā)合成代謝基因的表達(dá),，促進(jìn)軟骨發(fā)育，并對(duì) CMC 的內(nèi),、中,、外區(qū)域的軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解產(chǎn)生差異影響。

圖1     14 天的生理流體剪切應(yīng)力可保護(hù) CMC 免受細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解,，從而形成成熟的 3D CMC,。

為此,，用 TNF-α（100 ng ml）刺激 CMC 6 小時(shí)，發(fā)現(xiàn) TNF-α 刺激顯著降低了 Calcein-AM+ 細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量（作為細(xì)胞存活的衡量指標(biāo)）,，但在 0.2 Pa 模擬關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)降低程度較低,。此外，與未處理的 0.2 Pa 組相比,，0.2 Pa 的 TNF-α 處理導(dǎo)致 BCL2-BAX 比率降低,，但仍高于 0 Pa 組。WST-1 水平在 TNF-α 處理后在 0 Pa 時(shí)比在 0.2 Pa 時(shí)增加的程度更高,，表現(xiàn)出更高的代謝活性,，而 0.2 Pa 的 TNF-α 處理減少了氧攝取和乳酸產(chǎn)生，表明葡萄糖攝取降低,。然后,，分析了 TNF-α介導(dǎo)的 IL-6 分泌作為 CMC 炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移,，在 0 Pa 條件下 TNF-α 的降低伴隨著 IL-6 分泌的增加,，而在 0.2 Pa 條件下觀察到可溶性促炎細(xì)胞因子 IL-6 的水平顯著降低,。這些數(shù)據(jù)表明，生理性剪切力減少TNF-α刺激的CMC細(xì)胞凋亡和IL-6分泌,。

TNF-α 可以通過(guò)誘導(dǎo) MMPs 的表達(dá)導(dǎo)致聚集蛋白聚糖和 II 型膠原蛋白的降解,。因此，接下來(lái)研究了 0 和 0.2 Pa 剪切應(yīng)力對(duì) TNF-α介導(dǎo)的炎性 IL6,、TNFA 和 IL8,、促纖維化 TGFB 和參與 ECM 周轉(zhuǎn)的分子 ACAN、COL2A1,、COL1A1,、COMP、MMP1,、MMP3 和 MMP13 基因表達(dá)的影響（圖2 a）,。雖然 IL6、TNFA 和 IL8 不受不同剪切應(yīng)力的影響,，但與低生理力相比,，0.2 Pa 的生理剪切應(yīng)力降低了促纖維化 TGFB 和 COMP。值得注意的是,，0.2 Pa 的生理?xiàng)l件下 ACAN,、COL2A1 的表達(dá)顯著升高，COL1A1 表達(dá)降低,，從而增加 COL2A1 與 COL1A1 的比率,。TNF-α刺激后 MMP1 和 MMP13 在 0 Pa 時(shí)的表達(dá)顯著升高（圖2 a）。

利用免疫熒光分析確定負(fù)責(zé)維持 0.2 Pa 下 CMC 生理機(jī)能的區(qū)域,，發(fā)現(xiàn)CMCs 的內(nèi)部區(qū)域?qū)羟袘?yīng)力引起的 ECM,、COL2 和 ACAN 的合成代謝分子的變化敏感。外部區(qū)域?qū)?ECM 的分解代謝分子,，即 MMP1 和 MMP13 敏感（圖2 b,、c）。值得注意的是,，ACAN 似乎也受到了外部區(qū)域的影響,。

這些結(jié)果表明，0.2 Pa 的生理剪切應(yīng)力可能在維持 MPS 中的 CMC 穩(wěn)態(tài)方面具有保護(hù)作用,，而 0 Pa 的低生理剪切應(yīng)力則支持 CMC 損傷,。

圖2    生理剪切應(yīng)力可防止 TNF 介導(dǎo)的 CMC 損傷，維持 CMC 穩(wěn)態(tài),，而低生理剪切應(yīng)力支持 TNF 介導(dǎo)的 CMC 損傷,。

最后，添加 JAK 抑制劑（JAKi）巴瑞替尼（baricitinib）處理 PBMCs 和 CMCs（圖3 a）,。確認(rèn)了添加活化的 PBMCs 或它們與巴瑞替尼的組合不會(huì)影響 CMCs 的活力,、細(xì)胞毒性或細(xì)胞凋亡（圖3 b,、c）。其次,，發(fā)現(xiàn) PBMC-介導(dǎo)的 caspase 3/7 活性的顯著誘導(dǎo)（圖3 c）和 BCL2 與 BAX 比率的降低（圖3 d）,，這被巴瑞替尼處理逆轉(zhuǎn)。添加活化的 PBMCs 導(dǎo)致軟骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞的代謝率改變,。雖然培養(yǎng)基的氧飽和度最初降低,，但與未處理的 CMCs 相比，兩天后氧飽和度增加,。添加巴瑞替尼恢復(fù)了培養(yǎng)基的氧飽和度（圖3 e）,。值得注意的是,，培養(yǎng)基氧飽和度的降低表明細(xì)胞耗氧量增加,。用活化的 PBMCs 處理的 CMCs 中培養(yǎng)基中葡萄糖的含量比單獨(dú)的 CMCs 減少得少，但比用活化的 PBMCs 和添加巴瑞替尼處理的 CMCs 減少得更多（圖3 f）,。當(dāng)用活化的 PBMCs 處理 CMCs 時(shí),，乳酸量隨著時(shí)間的推移而增加。相反,，添加巴瑞替尼導(dǎo)致乳酸水平與在未處理的 CMCs 中觀察到的乳酸水平相似（圖3 f）,。

在基因表達(dá)水平上，免疫細(xì)胞介導(dǎo)的 CMCs 激活顯著增加了 IL6 和 IL1B 以及基質(zhì)降解酶的表達(dá),，這導(dǎo)致 RA 的關(guān)鍵現(xiàn)象——軟骨降解（圖3 g）,。這些影響也可以通過(guò) JAK 抑制來(lái)減弱。在形態(tài)學(xué)上,，含有細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞的外部區(qū)域在使用活化的 PBMCs 刺激后消失,，從而顯示出淺表細(xì)胞層浸漬的跡象（圖3 h）。此外,，免疫細(xì)胞誘導(dǎo)導(dǎo)致軟骨 ECM 分解的 MMP1 和 MMP13 表達(dá)增加,，并被巴瑞替尼消除（圖3 h）。

關(guān)節(jié)炎 CMC 的藥理學(xué)驗(yàn)證了,，活化的 PBMCs 降低 ACAN 和 COL2A1 表達(dá)并促進(jìn) MMP1 和 MMP13表達(dá),，而 JAK 抑制劑巴瑞替尼則相反。

圖3    激活的 PBMCs 誘導(dǎo)體液介導(dǎo)的 CMC 損傷,、炎癥介質(zhì)和 MMP,，這些損傷被隨后的 JAK 抑制減弱。

該研究揭示了關(guān)節(jié)炎樣表型的發(fā)展,，并在生理剪切應(yīng)力下,，通過(guò) JAK 抑制劑成功恢復(fù)了軟骨狀況。生理剪切應(yīng)力被認(rèn)為是維持軟骨完整性的關(guān)鍵因素,。該 MPS 提供了一種標(biāo)準(zhǔn)化方法來(lái)研究剪切應(yīng)力,、復(fù)制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的軟骨損傷和模擬關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵特征,，為動(dòng)物模型提供了有價(jià)值的替代方案。

參考文獻(xiàn)：Damerau A, Nguyen DHD, Lubahn C, Renggli K, Pfeiffenberger M, Kr?nke G, Herrmann M, Leeuw T, Buttgereit F, Gaber T. Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 24:e2412010. doi: 10.1002/advs.202412010. Epub ahead of print. PMID: 39716911.

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