一,、重組蛋白表達的原理

重組蛋白表達是利用DNA重組技術(shù)，將目標基因（外源基因）導(dǎo)入宿主細胞中,，并通過宿主細胞的生物機制使其表達出特定蛋白,。其主要步驟包括：

基因克隆：將目標基因經(jīng)過PCR擴增后,，與表達載體連接,，形成重組質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞中,，可以使用化學(xué)方法,、電穿孔或者嗜熱菌等方式進行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。

表達蛋白：重組質(zhì)粒進入宿主細胞后,，融合到宿主細胞的染色體中,，隨后遵循細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制，表達出目標蛋白,。

二,、常見的重組蛋白表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)：大腸桿菌是常用的重組蛋白表達宿主細胞之一。其優(yōu)點在于生長快速,、易于培養(yǎng),，并且能夠產(chǎn)生大量的蛋白。此外,，大腸桿菌的遺傳工具和代謝途徑也被廣泛研究,，提供了便利。

酵母表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)包括釀酒酵母和畢赤酵母,。這些酵母細胞具有真核細胞的特點,，能夠進行正確的蛋白折疊和修飾。同時,，酵母細胞也可以進行大規(guī)模培養(yǎng)和高表達,，適用于一些復(fù)雜蛋白的表達。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)：昆蟲細胞表達系統(tǒng)常用于大規(guī)模蛋白表達,。昆蟲細胞具有真核細胞的優(yōu)勢,，能夠?qū)Φ鞍走M行正確的折疊和修飾，適合于表達大量需求復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重組蛋白,。

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)可用于高效表達復(fù)雜蛋白和進行蛋白質(zhì)研究,。哺乳動物細胞具有真核細胞特點，能夠進行正確的蛋白質(zhì)修飾和折疊,，并且在一些特殊情況下需要考慮到人類蛋白的免疫原性,。

三、重組蛋白生產(chǎn)步驟

細胞中有兩個蛋白生產(chǎn)階段：轉(zhuǎn)錄和翻譯,，被稱為分子生物學(xué)的中心法則,。換言之,，轉(zhuǎn)錄和翻譯步驟屬于重組蛋白表達步驟。

為了生產(chǎn)重組蛋白,，基因被分離并克隆到表達載體中,。重組蛋白的生產(chǎn)需要蛋白表達系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)和蛋白識別系統(tǒng),。

獲取重組蛋白的基本步驟：

1.目標基因的擴增,。

2.插入克隆載體。

3.亞克隆到表達載體中,。

4.轉(zhuǎn)化到蛋白表達宿主中(細菌(大腸桿菌),、酵母細胞、哺乳動物細胞或桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)),。

5.重組蛋白鑒定試驗(Western blot或熒光)

6.大規(guī)模生產(chǎn),。(大規(guī)模發(fā)酵)

7.分離和純化。

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