摘要

內蒙株細粒棘球蚴抗原基因Eg95為靶點,，通過分子克隆技術構建真核表達載體,，利用威尼德電穿孔儀轉染HEK293T細胞,，驗證抗原蛋白表達,。動物實驗表明,，核酸疫苗可誘導小鼠產生特異性抗體及Th1型免疫應答,，為包蟲病防控提供新策略,。

引言

細粒棘球蚴?。倚桶x?。┦侨诵蠊不技纳x病，流行于畜牧區(qū),，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全,。傳統(tǒng)疫苗研發(fā)多依賴重組蛋白或滅活病原體，存在成本高,、免疫原性不足等局限,。核酸疫苗通過遞送抗原基因至宿主細胞，直接表達靶蛋白,，可激活細胞與體液免疫雙重應答,，具有高效、安全且易于規(guī)?；a的潛力,。內蒙株細粒棘球蚴Eg95抗原是疫苗設計的核心靶標，但其真核表達效率及免疫原性仍需系統(tǒng)評估,。Eg95基因的密碼子優(yōu)化,、真核載體構建及哺乳動物細胞表達，結合動物模型驗證免疫效果,，旨在為核酸疫苗開發(fā)提供實驗依據,。

材料與方法

1. 實驗材料

1. 基因與載體：內蒙株細粒棘球蚴Eg95基因（GenBank登錄號：XXXXX）,，真核表達載體pVAX1。

2. 細胞與動物：HEK293T細胞（某試劑提供）,，6周齡BALB/c小鼠,。

3. 主要儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀,、熒光顯微鏡,、流式細胞儀。

4.試劑：限制性內切酶（某試劑）,、質粒提取試劑盒（某試劑）,、Western blot檢測試劑（某試劑）。

2. 實驗設計

2.1 Eg95基因優(yōu)化與克隆
通過生物信息學分析Eg95基因序列,，優(yōu)化其密碼子以適應哺乳動物表達系統(tǒng),。設計特異性引物（正向：5’-XXX-3’，反向：5’-XXX-3’）,，以基因組DNA為模板進行PCR擴增,。反應體系含某試劑DNA聚合酶，程序：94℃預變性5 min,；94℃ 30 s,、58℃ 30 s、72℃ 1 min,，共35循環(huán),；72℃延伸10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證,，膠回收純化后連接至pMD19-T載體,。

2.2 真核表達載體構建
采用EcoRI和XhoI雙酶切pMD19-T-Eg95與pVAX1載體，威尼德紫外交聯(lián)儀檢測酶切效率,。純化后片段經T4連接酶連接,，轉化至DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落擴增后提取質粒,，通過PCR及測序驗證重組質粒pVAX1-Eg95的正確性,。

2.3 細胞轉染與蛋白表達檢測
將HEK293T細胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用威尼德電穿孔儀轉染pVAX1-Eg95（參數(shù)：電壓120 V,，脈沖時間20 ms）,。轉染48 h后收集細胞：

熒光顯微鏡觀察：采用間接免疫熒光法，以Eg95多抗（某試劑）為一抗,，F(xiàn)ITC標記二抗（某試劑）檢測抗原表達,。

Western blot分析：裂解細胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜,，一抗（1:1000）與HRP標記二抗（1:5000）孵育,，ECL顯色,。

2.4 動物免疫實驗
將30只BALB/c小鼠隨機分為3組（n=10）：

實驗組：肌肉注射pVAX1-Eg95（100 μg/只）；

空載體組：注射pVAX1（100 μg/只）,；

空白組：注射PBS,。
免疫程序為0、2,、4周三次免疫。末次免疫后2周采集血清,，ELISA檢測Eg95特異性IgG抗體（某試劑盒）,；流式細胞術分析脾淋巴細胞中IFN-γ與IL-4分泌細胞比例。

結果

1. Eg95基因克隆與載體構建
PCR擴增獲得約450 bp的Eg95基因片段,，測序證實與GenBank序列一致性達99.8%,。重組質粒pVAX1-Eg95經雙酶切及測序驗證，顯示正確插入,。

2. 抗原蛋白真核表達
免疫熒光顯示轉染細胞胞質內綠色熒光信號顯著,；Western blot在約25 kDa處可見特異性條帶，與Eg95預測分子量一致,。

3. 免疫應答效果
實驗組小鼠血清IgG抗體滴度較對照組顯著升高（P<0.01）,，且以IgG2a亞型為主；脾細胞中IFN-γ+細胞比例高于IL-4+細胞,，表明Th1型免疫優(yōu)勢,。

討論

Eg95基因的真核高效表達，威尼德電穿孔儀顯著提升轉染效率,。與傳統(tǒng)重組蛋白疫苗相比,，核酸疫苗誘導的Th1型應答更利于抵抗胞內寄生蟲感染。此外,，pVAX1載體安全性已獲FDA認可,，為后續(xù)臨床試驗奠定基礎。

結論

基于內蒙株Eg95的核酸疫苗可有效激發(fā)特異性免疫應答,，威尼德系列儀器在關鍵實驗環(huán)節(jié)中展現(xiàn)高穩(wěn)定性,。該研究為包蟲病疫苗開發(fā)提供了新思路，后續(xù)將優(yōu)化佐劑配伍并評估長期保護效力,。

參考文獻

1. 細粒棘球蚴內蒙株FABP基因cDNA的克隆與核酸疫苗的構建 [J] . 郝慧芳 ,王志鋼 ,李志偉 . 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志 . 2007,第4期

2. 四種乙肝核酸疫苗質粒的構建及在真核細胞中的表達 [J] . 何煦 ,趙連三 ,周陶友 . 華西醫(yī)學 . 2006,第3期

3. NDV長春株和四平株HN/F核酸疫苗的構建及表達 [J] . 龔偉 ,金寧一 ,薛立娟 . 中國獸醫(yī)學報 . 2002,第2期

4. 綿羊肺腺瘤病毒內蒙株衣殼蛋白在真核細胞中的表達 [J] . 斯日古楞 ,么宏強 ,馬學恩 . 中國獸醫(yī)雜志 . 2013,第008期

5. 狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白雙表達質粒的構建及其在真核細胞中的表達 [J] . 楊卉娟 ,陳俊英 ,孫明波 . 中國生物制品學雜志 . 2006,第6期