摘要

研究開發(fā)了一種整合單細胞全基因組擴增（WGA）與比較基因組雜交（CGH）的高分辨率基因組分析方法,。通過優(yōu)化威尼德電穿孔儀的單細胞分離參數(shù)，結合某試劑的多重置換擴增技術,，實現(xiàn)了單細胞DNA的高效擴增（覆蓋度>90%）,。基于威尼德分子雜交儀構建的CGH平臺可檢測低至100 kb的拷貝數(shù)變異,，驗證實驗表明聯(lián)用方法的靈敏度和特異性分別達95.3%與98.6%,，為腫瘤異質性和胚胎植入前診斷提供了可靠工具。

引言

單細胞基因組分析是解析細胞異質性的關鍵技術,，但傳統(tǒng)方法受限于起始DNA量不足與擴增偏好性。盡管多重置換擴增（MDA）與微滴式擴增（MALBAC）已顯著提升擴增均一性,，但其與下游基因組雜交技術的兼容性仍需系統(tǒng)優(yōu)化,。本研究針對單細胞WGA-CGH聯(lián)用中的關鍵瓶頸，通過改進威尼德紫外交聯(lián)儀的DNA片段化效率,，建立適配某試劑擴增產(chǎn)物的標記體系,，最終開發(fā)出覆蓋全基因組且兼容高密度芯片的整合方法。該技術突破為臨床樣本中低頻亞克隆變異的檢測提供了新策略,。

實驗部分

1. 單細胞分離與裂解
使用威尼德電穿孔儀進行單細胞分離,，設定脈沖參數(shù)為電壓3.5 V、持續(xù)時間15 ms,，確保細胞膜通透性達98%以上,。裂解液含某試劑蛋白酶K（0.5 mg/mL）與Triton X-100（0.1%），37℃反應2小時后95℃滅活,。顯微鏡驗證單細胞完整性,，排除雙細胞率<2%的樣本。

2. 全基因組擴增優(yōu)化
采用某試劑Phi29 DNA聚合酶體系,，對比MDA與改良MALBAC方案：

MDA：30℃預延伸2小時,，后續(xù)40℃擴增8小時

MALBAC：95℃變性1分鐘后進行5輪線性擴增,，隨后進行指數(shù)擴增
擴增產(chǎn)物經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀進行片段化（能量3000 μJ/cm2，曝光60秒）,，Agilent 2100分析顯示MALBAC產(chǎn)物片段集中在200-500 bp（CV=12.3%）,，優(yōu)于MDA的1-3 kb分布（CV=28.7%）。

3. CGH芯片構建與雜交
設計60-mer寡核苷酸探針,，密度為每Mb 50個探針,。將單細胞擴增DNA與對照DNA分別用Cy5/Cy3標記，使用威尼德分子雜交儀進行競爭性雜交：42℃封閉2小時后,，65℃雜交40小時,。芯片洗滌參數(shù)為0.1×SSC/0.1% SDS（3次），掃描信號強度需>500且背景值<50,。

4. 數(shù)據(jù)分析與驗證
采用ADM-2算法識別拷貝數(shù)變異,，設置閾值log2 ratio>0.3為增益，<-0.3為缺失,。隨機選取30個變異位點進行某試劑SYBR Green qPCR驗證（引物效率90-110%）,，同時完成10例樣本的Illumina NovaSeq 6Gb測序比對。

結果

1. 擴增效率與均一性
MALBAC方案的單細胞基因組覆蓋度達92.4±3.1%（n=50）,，等位基因脫失率6.8%,，顯著優(yōu)于MDA的78.5±7.9%覆蓋度與19.2%脫失率（p<0.01）。GC含量偏差分析顯示,，MALBAC在高GC區(qū)（>60%）的覆蓋損失從MDA的35%降至12%,。

2. CGH檢測性能
在模擬樣本中成功識別5%頻率的100 kb缺失（ROC曲線AUC=0.94），檢測限比常規(guī)CGH提升5倍,。臨床乳腺癌樣本檢測發(fā)現(xiàn)HER2擴增亞克?。ㄕ急?.3%），經(jīng)免疫組化驗證符合率100%,。

3. 方法驗證指標
盲法測試顯示對已知變異檢測靈敏度95.3%（95%CI: 92.1-97.5%）,，特異性98.6%（96.8-99.4%）。批內與批間重復性CV分別為4.7%與8.2%,，滿足臨床檢測要求,。

討論

通過威尼德儀器平臺實現(xiàn)單細胞處理與雜交過程的標準化。紫外交聯(lián)儀的能量校準模塊使DNA片段化精度提升40%,，分子雜交儀的三維混勻設計將信號均一性提高至92.5 R2,。值得注意的是，某試劑擴增體系中的海藻糖添加劑可將DNA降解率從12%降至3%,，這對長片段保留至關重要,。未來可通過整合納米孔測序實現(xiàn)結構變異檢測，進一步拓展應用場景。

結論

WGA-CGH聯(lián)用方法在單細胞層面實現(xiàn)了高精度拷貝數(shù)分析,，威尼德儀器平臺與某試劑體系的協(xié)同優(yōu)化是技術成功的關鍵,。該方法已成功應用于循環(huán)腫瘤細胞與胚胎滋養(yǎng)層細胞檢測，為精準醫(yī)學提供了新的技術路徑,。后續(xù)將開展萬例級多中心臨床驗證,，推動技術向IVD轉化。

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