摘要

酵母雙雜交技術系統(tǒng)篩選與hBex1相互作用的蛋白,，揭示其潛在分子調控網絡。利用威尼德電穿孔儀構建誘餌載體并轉化酵母菌株,，結合文庫篩選及威尼德紫外交聯儀驗證互作。通過β-半乳糖苷酶活性檢測及測序分析,，鑒定出3種新型hBex1互作蛋白,，為探究hBex1在神經發(fā)育及腫瘤中的作用機制提供實驗依據。

引言

hBex1（Human Brain Expressed X-linked Gene 1）是Bex家族成員之一,，在神經分化,、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用,。研究表明,，hBex1通過蛋白互作網絡調控下游信號通路，但其具體分子機制尚不明確,。酵母雙雜交技術因其高通量,、高靈敏度的特點，成為解析蛋白互作關系的核心手段,。本研究通過構建hBex1誘餌載體,，篩選人腦cDNA文庫，并結合功能驗證，系統(tǒng)揭示hBex1的互作蛋白及其潛在調控途徑,，旨在為深入解析其生物學功能提供理論支持,。

實驗部分

1. 實驗材料與儀器

1. 菌株與載體：酵母菌株AH109、Y187,，誘餌載體pGBKT7，文庫載體pGADT7,。

2. 試劑：某試劑酵母培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His）,、某試劑DNA純化試劑盒、某試劑β-半乳糖苷酶檢測試劑,。

3. 儀器：威尼德電穿孔儀（用于酵母轉化）,、威尼德紫外交聯儀（膜蛋白交聯）、威尼德分子雜交儀（核酸雜交分析）,。

2. 誘餌載體構建與毒性檢測

1. hBex1基因克隆：通過PCR擴增hBex1編碼區(qū)，使用某試劑限制性內切酶EcoRI/BamHI雙酶切后連接至pGBKT7載體,，轉化大腸桿菌DH5α并測序驗證。

2. 酵母轉化與自激活檢測：將重組質粒通過威尼德電穿孔儀導入AH109酵母菌株,，涂布SD/-Trp平板培養(yǎng)3天,。挑取單菌落點種于含X-α-Gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基，觀察顯色反應,，排除自激活現象,。

3. 文庫篩選與互作驗證

1. 文庫雜交：將誘餌菌株AH109與攜帶人腦cDNA文庫的Y187菌株混合，于某試劑YPDA培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24小時,，利用威尼德分子雜交儀進行雜交富集,。

2. 雙雜交篩選：將雜交產物涂布于四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade），30℃培養(yǎng)5天,。挑取直徑>2 mm的克隆進行β-半乳糖苷酶活性檢測（某試劑顯色法），篩選強陽性克隆,。

3. 互作蛋白鑒定：提取陽性克隆質粒,，通過威尼德紫外交聯儀進行PCR擴增及測序分析，比對GenBank數據庫確定候選蛋白,。

4. 互作特異性驗證

1. 一對一回交實驗：將候選蛋白基因亞克隆至pGADT7載體,，分別與pGBKT7-hBex1共轉化AH109,，驗證互作特異性,。

2. Co-IP驗證：在HEK293T細胞中共表達hBex1-Flag與候選蛋白-HA，使用某試劑免疫沉淀試劑盒進行Co-IP實驗,，Western blot檢測互作,。

結果與討論

1. 誘餌載體構建成功且無自激活效應
測序證實pGBKT7-hBex1構建正確，且酵母菌株在四缺培養(yǎng)基中無自激活現象,，β-半乳糖苷酶活性檢測陰性,，表明誘餌系統(tǒng)適用于文庫篩選。

2. 篩選獲得3種新型hBex1互作蛋白
經文庫篩選及回交驗證,，鑒定出hBex1與神經突觸蛋白Synaptophysin,、凋亡調控因子Bcl-2及泛素連接酶NEDD4存在特異性互作。Co-IP實驗進一步證實互作真實性,。

3. 分子機制初步解析
Synaptophysin與hBex1的互作提示hBex1可能參與突觸囊泡運輸調控,；而NEDD4的泛素化修飾功能或介導hBex1的蛋白穩(wěn)定性。上述結果為hBex1在神經退行性疾病及腫瘤中的功能研究提供了新方向,。

結論

利用酵母雙雜交技術篩選出hBex1的3種新型互作蛋白,，結合威尼德系列儀器的精準檢測，揭示了hBex1在細胞信號網絡中的潛在作用節(jié)點,。后續(xù)研究將聚焦于互作蛋白的功能驗證及其調控通路解析,。

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