四,、定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò) 增
1. 引物設(shè)計(jì)要求：5’- 15-21bp 反向互補(bǔ)區(qū)域 + 至少 15bp 非互補(bǔ)區(qū)域 -3’，反向互補(bǔ)區(qū)域 GC含量 40%-60%,，待突變位點(diǎn)至引物 3 ’ 端 Tm 值 >60°C,。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對(duì)應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；
2. 建議使用試劑盒搭配的擴(kuò)增模塊進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,，并摸索退火溫度,，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序,；
3. PCR 擴(kuò)增體系的模板質(zhì)粒投入量推薦 50 μl 體系投入 1 ng，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)當(dāng)≤ 35 個(gè),。

擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化和純化回收

1.取 5μl 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,，判斷是否存在目的大小的條帶后，剩余產(chǎn)物使用 DpnI 消化（45μl 擴(kuò)增產(chǎn)物加入 1 μl DpnI,，輕輕吸打混勻后,，在 PCR 儀中 37°C反應(yīng) 1-2 h消化質(zhì)粒模板，再 70°C反應(yīng) 15 min 使 DpnI 失活）,；
2. 推薦使用切膠回收的方式純化（切膠時(shí)間最好控制在 3 min 內(nèi),，避免紫外照射對(duì) DNA 的損傷），回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測(cè),，濃度應(yīng)≥ 20ng/μl,，并跑膠鑒定回收產(chǎn)物是否為單一目的條帶；

3. 回收濃度低時(shí),，可通過增加反應(yīng)體系,，采取多管反應(yīng)單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度,。

重組反應(yīng)

1.連接反應(yīng)體系按照說明書要求計(jì)算投入量,，體系中各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用,；
2.連接反應(yīng)程序按照說明書要求進(jìn)行,，建議在 PCR 儀中反應(yīng)。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化

1. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞選擇使用 DH5α,、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,；
2. 感受態(tài)細(xì)胞不可反復(fù)凍融使用，-80°C取出后建議一次用完,；
3. 重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10,，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞；
4. 熱激時(shí)間：按照感受態(tài)細(xì)胞說明書操作進(jìn)行,；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致,；
6. 菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min）,，移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板,；或吸取合適體積涂板,。

常見問題分析：

質(zhì)粒模板無(wú)法正常擴(kuò)增
1. 引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤：反向互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)度應(yīng)為 15-21bp 之間，過長(zhǎng)過短均影響重組效率,；GC 含量以 40-60% 之間最適,，超出范圍影響重組效率,。建議使用 CE Design 在線設(shè)計(jì)；
2. 質(zhì)粒模板質(zhì)量差：凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒模板,，若出現(xiàn)開環(huán),、線性條帶、拖尾等條帶,，說明模板質(zhì)量差,，需重新制備；
3. PCR 反應(yīng)體系 / 程序設(shè)置不當(dāng)：質(zhì)粒模板投入量過多會(huì)抑制 PCR 反應(yīng),，建議 50μl 體系投入 1ng,；基于上下游引物 Tm 值，設(shè)定適宜范圍進(jìn)行梯度摸索,；質(zhì)粒長(zhǎng)度超過 8kb 時(shí),，可嘗試變更為雙 / 多點(diǎn)突變策略，分段擴(kuò)增,。

公式計(jì)算投入量,；濃度過高時(shí)需稀釋使用,，保證體系投入體積不小于 1μl。