一,、 測定原理

ORAC 法(oxygen radical absorbance capacity,，氧自由基吸收能力)是由 Cao 等在 Glazer  研究的基礎上發(fā)展起來的抗氧化能力的測定方法。它具有生物相關性強,，可以通過改變自由 基和反應體系的溶劑測定脂溶性和水溶性物質的抗氧化活性,，方法的專一性強等優(yōu)點(趙建 等，2011),，因而近年在研究領域廣泛應用,。

該方法以偶氮類化合物作為自由基來源，熒光素鈉作為指示劑,，水溶性維生素 E（Trolox） 為標準物質進行抗氧化分析,。氧自由基通過氫原子轉移（HAT）過程使熒光探針氧化，并隨 著時間的推移淬滅熒光探針(Huang et al., 2015),。分析中存在的抗氧化劑可阻止熒光探針氧化,， 推遲熒光的猝滅，直至樣品中的抗氧化劑活性耗盡,。因此可以通過熒光衰減的曲線來計算抗 氧化物質的氧自由基清除能力：樣品的氧自由基清除能力越強,，熒光素鈉的淬滅越慢，則熒 光強度曲線下面積(AUC)越大,。

二,、 試劑及耗材組成

稀釋液：100 mL×1 瓶

試劑一：熒光素鈉 100μL ×1 支

試劑二：自由基引發(fā)劑 粉劑 ×1 支

陽性對照：1mM Trolox 標準溶液 1mL×1 支（乙醇配制）

黑色熒光酶標板 ×1 片

試劑一配制瓶 ×1 個

加樣槽 ×1 個

三、 儲存條件及有效期

-20℃可保存 6 個月,。

四,、 試劑的配制

試劑一應用液：將試劑一小心轉入 10mL 稀釋液中,，采用試劑一配制瓶配制,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑二應用液：在試劑二瓶內(nèi)加入 15mL 稀釋液,，冰上配制,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Trolox 標準溶液：首先將 1mM Trolox 標準溶液使用稀釋液¹按照 1：25 稀釋成 40μM 溶液(最終體系為 200μL,，樣品/trolox 添加量為 50μL,，因此 40μM trolox 的體系終濃度為 10μM)。

稀釋方法：取 1mM Trolox 標準溶液 400μL,，加入 9.6mL 稀釋液,，充分搖勻，得到終濃 度為 10μM Trolox 溶液 10mL（實際濃度為 40μM）,。

按照下表稀釋得到不同濃度的 Trolox 標準溶液²：

¹ 稀釋液一般應該與樣品稀釋液保持一致,，水溶性樣品可直接采用本試劑盒提供的稀釋液,， 脂溶性樣品需自備稀釋液；

² 標準曲線不是必需步驟,，但是推薦制作,。表中給出的濃度為建議值，您也可以根據(jù)自己樣 品的抗氧化能力適當調整標準曲線范圍,。

五,、 操作步驟

直接在黑色熒光酶標板按照下表加樣：

充分混勻，37℃避光靜置

充分混勻²,，立即采用酶標儀進行測定,，酶標儀設定參數(shù)如下：

振蕩時間：5s（可選） 

孵育溫度：37℃； 

激發(fā)波長：485±20nm,； 

發(fā)射波長：520±20nm,； 

讀取方式³：1-5min 讀取 1 次，連續(xù)讀取 60 - 90 min 

¹迅速加入,，建議使用多道移液器快速加入,； 

² 如酶標儀具備振蕩功能，建議使用酶標儀振蕩以節(jié)約時間,； 

³ 至少反應 60min,，2min 讀取一次數(shù)據(jù)；也可將讀取時間延長至 90min,。

六,、計算方法

1.計算曲線下面積(AUC) 

將讀取得到的初始熒光值(即開始檢測后第一次讀取的熒光值)記為 F0，第 n 次檢測讀取 得到的熒光值記為 Fn,，則采用微積分的思路,，AUC 可由如下公式計算： 

AUC = F0/F0 + F1/F0 + F2/F0 + …… + Fn/F0 

2. 計算凈曲線下面積（netAUC） 

如下圖所示，首先如上述計算不加任何抗氧化劑的孔（空白）的 AUC,，得到空白 AUC （AUCblank）,，將樣品（標準品）AUCsample 值減去 AUCblank，即為凈曲線下面積（netAUC）,。 

netAUC = AUCsample –AUCblank 

3. 制作標準曲線 

將各濃度 Trolox 計算得到的 netAUC 線性擬合成為標準曲線,。 

例如：計算得到 netAUC 和標準曲線如下： 

4. 通過標準曲線計算樣品等價的 Trolox 當量 

如計算得到樣品溶液 netAUC 值為 6.66，根據(jù)標準曲線計算可知,，該樣品溶液與 0.57 μM  TE 的 netAUC 相等,，則該樣本溶液 ORAC 值為 0.57 μM TE (Trolox equivalent) . 如已知樣本溶液的濃度為 100 μg/mL，則可進一步計算該樣品的 Trolox 當量為 5.7 μmol TE/g,。

七,、注意事項

1. 本試驗需要使用到具有熒光功能的酶標儀，建議使用同時具備熒光測定,、孵育,、振搖和 酶促動力學讀取功能的酶標儀,。請在試驗前確定實驗室具備此測定條件，且在試驗前先行了 解測試程序的設置,；

2. 請事先準備好多道移液器（排槍）,；

3. 建議先將樣品梯度稀釋后進行預試驗，不在標準曲線的線性范圍內(nèi)會造成較大誤差,；

4. 試劑二應用液建議在加入試劑一應用液后的等待時間內(nèi)配制,，以盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用。同時,， 試劑二請務必迅速加入,，盡可能保證各孔加樣時間一致，以減小系統(tǒng)誤差(Mellado-Ortega et al., 2017),。

5. netAUC 可不計算,，只是標準曲線不過原點，但不影響結果準確性,。本說明書中給出的計 算方法是較為簡單的一種,，也可參考相應論文中較為嚴謹?shù)挠嬎愎健?/p>

6. ORAC 測試的樣品既可為脂溶性，也可為水溶性,。脂溶性樣品處理更為復雜,，因此更推薦采用親水溶劑制備樣品。