PCR(聚合酶鏈式反應)是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右),，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈,。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度,，復性溫度,，延伸溫度之間很好地進行控制。

PCR反應的特異性決定因素：

1,、引物與模板DNA特異正確的結合,；

2、堿基配對原則,；

3,、Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

4,、靶基因的特異性與保守性,。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的,。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加,，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度,。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高,。

PCR 反應特異性提高的方法：　　

1. 引物的設計

　　引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設計,，長度 15-30bp，GC 含量小于 60%,，3’端不超過連續(xù)三個 G 或 C,，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體,，設計完成之后,，需進行 BLAST 檢測，如果與其他基因不具有互補性,，則可以進行下一步實驗,。

2. 降落 PCR

　　降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時,，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟,。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使 PCR 效率過低,，過低則會使非特異擴增過多,。這雖然可以通過反復嘗試來優(yōu)化，但費時費力,。降落 PCR 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法,。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有,。隨著退火溫度的降低,，非特異擴增會逐步增多,。但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢,，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率,。

3. 熱啟動擴增

　　采用熱啟動方法進行擴增,，是除了設計最佳引物之外，提高 PCR 反應特異性好的方式,。在一般的 PCR 反應中,，試劑的配置需在冰上進行，且要將 PCR 儀預熱,，這種方法就類似于熱啟動,，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性,，只要體系中有 DNA 鏈存在,，就會擴增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前wan全抑制酶的活性,，而zui有效的方法就是使用熱啟動 Taq 酶(或熱啟動高保真聚合酶)去擴增,，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到 95℃時恢復活性,，指導擴增,。

4. 巢式 PCR

　　采用巢式 PCR 進行擴增，在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度,。與普通 PCR 不同的是,，它采用兩對引物進行擴增，首先用第一對引物普通 PCR,，然后將第一輪擴增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增,。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。