引言：

農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物基因工程中重要的載體工具,，其感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)量直接影響外源基因的轉(zhuǎn)化效率,。本文將詳細(xì)介紹農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程,，結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化技巧與注意事項,，助您提升轉(zhuǎn)化成功率,，滿足科研與產(chǎn)業(yè)化需求,。

一,、什么是農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,？

感受態(tài)細(xì)胞指通過物理或化學(xué)處理使細(xì)菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài),。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備是植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的關(guān)鍵步驟，直接影響Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率,。目前主流方法為CaCl?化學(xué)法,，具有成本低、操作簡便的優(yōu)勢,。

二,、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

菌株選擇：常用EHA105,、GV3101等致病性缺失型農(nóng)桿菌

培養(yǎng)基：YEB液體培養(yǎng)基（配方：5g/L牛肉膏，1g/L酵母提取物,，5g/L蛋白胨,，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO?·7H?O,，pH7.0）

試劑：無菌0.1M CaCl?溶液,、液氮、50%甘油

設(shè)備：超凈工作臺,、離心機(jī),、恒溫?fù)u床、-80℃冰箱

三,、分步制備流程（含關(guān)鍵參數(shù)）

步驟1：菌種活化與擴(kuò)增

取-80℃保存的農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基,，28℃倒置培養(yǎng)48小時

挑取單菌落接種至5mL YEB液體培養(yǎng)基，28℃,、200rpm振蕩培養(yǎng)16-18小時

優(yōu)化提示：OD???達(dá)0.4-0.6時菌體處于對數(shù)生長期,，此時收獲細(xì)胞活性最佳

步驟2：菌體收集與預(yù)冷處理

將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50mL離心管,，冰浴10分鐘

4℃,、5000g離心10分鐘，棄上清

加入10mL預(yù)冷0.1M CaCl?溶液,，輕柔重懸菌體

冰浴30分鐘,，再次4℃離心10分鐘

關(guān)鍵點(diǎn)：全程保持低溫（0-4℃），防止菌膜結(jié)構(gòu)受損

步驟3：感受態(tài)細(xì)胞制備

棄上清,，加入2mL預(yù)冷0.1M CaCl?溶液（含15%甘油）

輕柔吹打重懸,，分裝至1.5mL離心管（每管100μL）

液氮速凍1分鐘后轉(zhuǎn)入-80℃長期保存

配方優(yōu)化：添加終濃度10mM MgCl?可提升DNA結(jié)合效率

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