摘要

分子克隆技術(shù)構(gòu)建了人胰島新生相關(guān)蛋白（Islet Neogenesis-Associated Protein,，INGAP）基因的重組表達(dá)載體,，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),。利用威尼德電穿孔儀完成酵母轉(zhuǎn)化,，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,，采用SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白表達(dá),。結(jié)果表明,，成功獲得分子量約28 kDa的可溶性INGAP蛋白,，為后續(xù)功能研究及生物醫(yī)藥應(yīng)用奠定基礎(chǔ),。

引言

胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP）是一種具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和再生潛力的活性多肽，在糖尿病治療領(lǐng)域具有重要研究?jī)r(jià)值,。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在成本高,、周期長(zhǎng)等缺陷，而畢赤酵母（Pichia pastoris）憑借高密度發(fā)酵,、高效分泌表達(dá)及翻譯后修飾能力,，成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主,。然而，INGAP基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)仍面臨密碼子偏好性,、載體選擇及表達(dá)條件優(yōu)化等挑戰(zhàn),。本研究針對(duì)上述問題，設(shè)計(jì)特異性引物優(yōu)化INGAP基因序列,，構(gòu)建pPIC9K重組載體,，并通過多階段篩選策略獲得高表達(dá)菌株，為規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐,。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株與質(zhì)粒：畢赤酵母GS115（His-表型）、大腸桿菌DH5α,；質(zhì)粒pUC19-INGAP（含人INGAP cDNA）,、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K。

2. 主要試劑：某試劑限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ,、NotⅠ）,、某試劑T4 DNA連接酶、某試劑質(zhì)粒提取試劑盒,、某試劑PCR純化試劑盒,。

3. 儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀,、某品牌PCR儀,、某品牌凝膠成像系統(tǒng)。

2. 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 INGAP基因的密碼子優(yōu)化與擴(kuò)增
根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)INGAP基因（GenBank登錄號(hào)：NM_XXXXXX）進(jìn)行序列優(yōu)化,，合成全長(zhǎng)534 bp的DNA片段,。以pUC19-INGAP為模板，設(shè)計(jì)含EcoRⅠ/NotⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物（正向：5'-XXX-3',；反向：5'-XXX-3'）,，采用某品牌高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s,，58℃ 30 s,，72℃ 1 min；72℃終延伸10 min）,。

2.2 重組載體pPIC9K-INGAP的構(gòu)建
將PCR產(chǎn)物與pPIC9K載體分別經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切（37℃反應(yīng)4 h）,，某試劑瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。按插入片段:載體=3:1摩爾比混合,，使用某試劑T4 DNA連接酶16℃連接過夜,。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板,，37℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆,，經(jīng)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證陽性克隆,。

2.3 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化與篩選
將線性化的重組質(zhì)粒（經(jīng)SacⅠ酶切）通過威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV，25 μF,，200 Ω）轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞,。轉(zhuǎn)化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10??%生物素,，1%葡萄糖）,，30℃培養(yǎng)3天。挑取His+轉(zhuǎn)化子接種于含0.5-4 mg/mL G418的YPD平板進(jìn)行多濃度梯度篩選,，獲得高拷貝整合菌株,。

2.4 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)
將篩選菌株接種于BMGY培養(yǎng)基（30℃，250 rpm）培養(yǎng)至OD600=6,，離心后轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇）,，每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%。誘導(dǎo)72 h后收集上清,，經(jīng)某試劑Ni-NTA樹脂純化,。采用某試劑SDS-PAGE（15%分離膠）分析表達(dá)產(chǎn)物，威尼德紫外交聯(lián)儀轉(zhuǎn)膜后,，用鼠抗人INGAP單抗（1:1000稀釋）進(jìn)行Western blot驗(yàn)證,。

結(jié)果與分析

1. 重組質(zhì)粒構(gòu)建驗(yàn)證
菌落PCR顯示約550 bp特異性條帶，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳確認(rèn)534 bp插入片段與8.9 kb載體骨架,，測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化序列一致性達(dá)100%,。

2. 蛋白表達(dá)檢測(cè)
SDS-PAGE顯示誘導(dǎo)72 h的發(fā)酵上清在28 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與理論分子量一致,。Western blot結(jié)果顯示明顯單一條帶,，證實(shí)成功表達(dá)INGAP蛋白。

3. 表達(dá)條件優(yōu)化
對(duì)比不同甲醇濃度（0.5%-2%）發(fā)現(xiàn),，1%甲醇誘導(dǎo)時(shí)蛋白產(chǎn)量最高（1.2 mg/L）,。添加1%山梨醇可使表達(dá)量提升約30%，推測(cè)其通過緩解甲醇毒性維持細(xì)胞活性,。

討論

INGAP基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI值從0.68提升至0.92）,，顯著提高了翻譯效率。pPIC9K載體中α-factor信號(hào)肽的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá),，避免胞內(nèi)蛋白純化的復(fù)雜性,。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，電轉(zhuǎn)化后采用梯度G418篩選可有效富集多拷貝整合菌株,，與單拷貝菌株相比，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量提高4.6倍,。此外,，畢赤酵母在BMMY培養(yǎng)基中易發(fā)生自溶,，通過控制誘導(dǎo)時(shí)間≤72 h并添加滲透壓保護(hù)劑，可維持細(xì)胞完整性,。

結(jié)論

pPIC9K-INGAP重組表達(dá)載體,，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。Western blot證實(shí)目標(biāo)蛋白具有正確免疫原性,，為后續(xù)開展INGAP的生物學(xué)功能研究及糖尿病治療藥物開發(fā)提供了可靠的蛋白來源,。實(shí)驗(yàn)建立的載體構(gòu)建與表達(dá)優(yōu)化策略，可為其他小型分泌蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的高效表達(dá)提供參考,。

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