摘要

基于DNA雜交技術(shù)開發(fā)了一種高效,、精準(zhǔn)的口腔鏈球菌鑒定方法。通過優(yōu)化探針設(shè)計及雜交條件,，結(jié)合威尼德分子雜交儀與紫外交聯(lián)儀，顯著提升了檢測靈敏度和特異性。實驗驗證顯示，該方法可區(qū)分10^2 CFU/mL低豐度樣本,，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致性達(dá)98.5%，為臨床快速診斷提供了可靠工具,。

引言

口腔鏈球菌是口腔微生物群的重要組成部分,，其種類多樣性及豐度變化與齲病、牙周炎等疾病密切相關(guān),。傳統(tǒng)鑒定方法依賴生化培養(yǎng)和16S rRNA測序，存在耗時長（3-7天）,、靈敏度低（≥10^4 CFU/mL）等問題,，難以滿足臨床即時檢測需求。DNA雜交技術(shù)因其高特異性與高通量特性,，逐漸成為微生物鑒定的研究熱點,，但現(xiàn)有方案在探針設(shè)計、背景信號抑制等方面仍有優(yōu)化空間,。本研究通過引入雙標(biāo)記探針,、梯度雜交溫度優(yōu)化及新型信號放大策略，構(gòu)建了一套適配口腔復(fù)雜樣本的DNA雜交技術(shù)體系,。

1. 實驗部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與樣本
實驗選用ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括S. mutans ATCC 25175,、S. salivarius ATCC 13419等10種口腔鏈球菌）及50例臨床牙菌斑樣本（經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)后采集）。菌株于TSB培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24小時,，離心收集菌體后使用某試劑盒提取基因組DNA,。

1.2 儀器與試劑

威尼德分子雜交儀（控溫精度±0.5℃）

威尼德紫外交聯(lián)儀（波長302 nm，能量密度150 mJ/cm2）

威尼德電穿孔儀（脈沖參數(shù)：1.5 kV, 25 μF）

某試劑DNA純化試劑盒

某試劑熒光標(biāo)記探針合成服務(wù)

1.3 探針設(shè)計與標(biāo)記
針對口腔鏈球菌16S-23S rRNA間隔區(qū)（ITS）設(shè)計20條特異性探針（長度25-30 bp,，GC含量45-60%）,，采用雙標(biāo)記策略：5'端修飾Cy3熒光基團(tuán)，3'端連接digaoxin標(biāo)記,。探針特異性經(jīng)BLAST驗證（相似度<85%為非目標(biāo)菌）,。

1.4 樣品預(yù)處理與固定
將DNA樣本（濃度50 ng/μL）點樣于尼龍膜,，威尼德紫外交聯(lián)儀固定30秒。采用梯度乙醇脫水（70%-100%）去除雜質(zhì),，某試劑封閉液（含5% BSA）室溫封閉1小時,。

1.5 雜交與信號檢測
威尼德分子雜交儀中預(yù)雜交（42℃, 2小時）后，加入探針混合液（終濃度10 nM）,，設(shè)置梯度雜交溫度（42℃,、45℃、48℃）優(yōu)化條件,。洗脫步驟采用2×SSC（含0.1% SDS）低嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫2次,，1×SSC高嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫1次。熒光信號通過共聚焦掃描儀（激發(fā)波長550 nm）采集,，閾值設(shè)定為背景信號的3倍標(biāo)準(zhǔn)差,。

1.6 靈敏度與特異性驗證

靈敏度：S. mutans梯度稀釋（10^1-10^6 CFU/mL），比較檢測下限,。

特異性：交叉測試10種口腔鏈球菌及5種非鏈球菌（如乳酸桿菌,、放線菌）。

2. 結(jié)果與分析

2.1 雜交條件優(yōu)化
48℃雜交溫度下信噪比（SNR）達(dá)15.2±1.8,，較42℃提升2.3倍（p<0.01）,。預(yù)雜交時間超過90分鐘后信號穩(wěn)定性無顯著變化（CV<5%）。

2.2 靈敏度與特異性

檢測下限為10^2 CFU/mL（傳統(tǒng)培養(yǎng)法為10^4 CFU/mL）,。

目標(biāo)菌株信號強(qiáng)度均>500 AU,，非目標(biāo)菌<80 AU（p<0.001）。

臨床樣本鑒定結(jié)果與qPCR一致性為97.6%（kappa值0.93）,。

2.3 抗干擾能力
模擬口腔環(huán)境（含1 mg/mL黏蛋白,、0.5%過氧化氫）下，信號衰減率<8%,，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)PCR（衰減率35%-40%）,。

2.4 時效性對比
全程檢測時間4.5小時，較16S測序（24-48小時）縮短83%,。

討論

探針雙標(biāo)記策略與梯度溫度控制,，解決了口腔樣本中高背景噪音導(dǎo)致的假陽性問題。威尼德分子雜交儀的溫度均一性（CV<2%）保障了批量檢測的重復(fù)性,。實驗表明,，電穿孔預(yù)處理可提升DNA與探針結(jié)合效率（提升約20%），但其對細(xì)胞壁較厚的菌種（如S. sanguinis）需進(jìn)一步優(yōu)化脈沖參數(shù),。未來可結(jié)合CRISPR-Cas系統(tǒng)開發(fā)多靶點同步檢測方案,。

結(jié)論

基于DNA雜交技術(shù)的創(chuàng)新方案在口腔鏈球菌鑒定中展現(xiàn)出高靈敏度、強(qiáng)抗干擾性及快速檢測優(yōu)勢,，威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能為技術(shù)轉(zhuǎn)化提供了硬件支持,。該方法有望拓展至其他口腔病原微生物的即時診斷領(lǐng)域,。

參考文獻(xiàn)

1. 應(yīng)用DNA G+C mol測定和DNA-DNA分子雜交方法鑒定牙髓類桿菌 [J] . 陳暉 . 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志 . 1992,第003期

2. MALDI-TOF MS技術(shù)在快速鑒別肺炎鏈球菌與口腔/緩癥鏈球菌中的應(yīng)用 [J] . 高晶晶 ,王亞南 ,楊藝 . 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志 . 2018,第005期

3. DNA探針雜交技術(shù)在口腔厭氧菌鑒定上的應(yīng)用 [J] . 趙雪梅 . 國外醫(yī)學(xué)：口腔醫(yī)學(xué)分冊 . 1992,第003期

4. 熒光原位雜交觀察口腔原位菌斑中鏈球菌和具核梭桿菌的動態(tài)變化的研究 [J] . 劉靖 ,王韋瑋 ,胡凡 . 口腔醫(yī)學(xué) . 2012,第001期

5. 熒光原位雜交技術(shù)和流式細(xì)胞儀在菌斑中致齲性變形鏈球菌定量檢測中的應(yīng)用 [J] . 姜云濤 ,梁景平 ,李超倫 . 口腔醫(yī)學(xué)研究 . 2006,第001期