摘要

近年來(lái),，樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）腫瘤疫苗在免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出重要潛力。本研究聚焦RNA修飾技術(shù)對(duì)DC疫苗功能的影響,，通過(guò)優(yōu)化RNA轉(zhuǎn)染效率及穩(wěn)定性，探索其激活抗腫瘤免疫的分子機(jī)制,。實(shí)驗(yàn)表明,，化學(xué)修飾的RNA可顯著提升DC抗原呈遞能力，并通過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證了疫苗的抑瘤效果,。本研究為RNA修飾技術(shù)在腫瘤疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù),。

引言

樹(shù)突狀細(xì)胞作為抗原呈遞的核心細(xì)胞，其腫瘤疫苗的研發(fā)是腫瘤免疫治療的重要方向,。傳統(tǒng)DC疫苗依賴(lài)外源性抗原負(fù)載,，存在遞送效率低、免疫原性不足等問(wèn)題,。RNA修飾技術(shù)通過(guò)引入化學(xué)基團(tuán)（如假尿嘧啶,、5-甲基胞嘧啶）可增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性并降低先天免疫識(shí)別，從而提高DC的抗原呈遞效率,。然而,，RNA修飾類(lèi)型、修飾位點(diǎn)與DC功能調(diào)控的關(guān)聯(lián)機(jī)制尚未明確,。本研究系統(tǒng)評(píng)估了不同RNA修飾策略對(duì)DC成熟標(biāo)志物,、細(xì)胞因子分泌及T細(xì)胞激活能力的影響，結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明其作用通路,，為臨床轉(zhuǎn)化提供優(yōu)化方案,。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞來(lái)源：健康供體外周血單核細(xì)胞（PBMC）分化為未成熟DC（imDC）。

2. 試劑：某試劑RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,、某試劑細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒,、某試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。

3. 儀器：威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓300 V,，脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms）,、威尼德紫外交聯(lián)儀（能量劑量150 mJ/cm2）。

1.2 DC的分離與培養(yǎng)
采用密度梯度離心法分離PBMC,，以GM-CSF（50 ng/mL）和IL-4（20 ng/mL）誘導(dǎo)imDC分化,，培養(yǎng)第5天通過(guò)流式檢測(cè)CD11c?CD83?表型確認(rèn)純度＞90%。

1.3 RNA的制備與修飾

1. 模板設(shè)計(jì)：構(gòu)建編碼腫瘤抗原（如NY-ESO-1）的mRNA,，引入5'帽子結(jié)構(gòu)及3' polyA尾,。

2. 化學(xué)修飾：采用某試劑核苷酸類(lèi)似物,，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中將尿嘧啶替換為N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ），修飾比例設(shè)定為20%,、50%,、80%三組,。

3. 質(zhì)量控制：威尼德分子雜交儀檢測(cè)RNA完整性（RIN＞8.0）,，Nanodrop測(cè)定濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）。

1.4 DC疫苗制備與功能驗(yàn)證

1. RNA轉(zhuǎn)染：使用威尼德電穿孔儀（優(yōu)化參數(shù)：電壓250 V,，電容950 μF）將修飾后mRNA導(dǎo)入imDC,，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)檢測(cè)EGFP報(bào)告基因表達(dá)效率（＞70%為合格）。

2. DC成熟誘導(dǎo)：轉(zhuǎn)染后添加LPS（100 ng/mL）刺激48小時(shí),，流式檢測(cè)CD80,、CD86、HLA-DR表達(dá)水平,。

3. 細(xì)胞因子檢測(cè)：ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中IL-12p70,、IFN-γ及TNF-α濃度。

1.5 體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)評(píng)估

1. 動(dòng)物模型：BALB/c小鼠皮下接種CT26結(jié)腸癌細(xì)胞（5×10?/只）,，隨機(jī)分為PBS對(duì)照組,、未修飾RNA疫苗組、修飾RNA疫苗組（n=8）,。

2. 免疫方案：腫瘤直徑達(dá)5 mm時(shí),，皮下注射1×10?負(fù)載RNA的DC，每周1次,，共3次,。

3. 療效評(píng)價(jià)：監(jiān)測(cè)腫瘤體積（游標(biāo)卡尺測(cè)量）及生存期；處死后分離脾細(xì)胞,，通過(guò)威尼德原位雜交儀檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞比例,。

1.6 分子機(jī)制分析

1. TLR信號(hào)通路檢測(cè)：Western blot分析MyD88、TRIF蛋白表達(dá),；某試劑雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)評(píng)估NF-κB活性,。

2. RNA穩(wěn)定性測(cè)試：將修飾后RNA置于37℃血清環(huán)境中，威尼德紫外交聯(lián)儀定時(shí)取樣檢測(cè)降解速率,。

2. 結(jié)果與分析

2.1 RNA修飾顯著提升DC疫苗效能

50% m1Ψ修飾組的DC成熟標(biāo)志物（CD86?比例達(dá)82.3±4.1%）及IL-12p70分泌量（285.6±32.7 pg/mL）均顯著高于未修飾組（p<0.01）,。

修飾后RNA在血清中的半衰期延長(zhǎng)至未修飾組的3.2倍（24.5 h vs 7.6 h）。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗腫瘤效果

修飾RNA疫苗組小鼠腫瘤體積較對(duì)照組縮小67.4%（p<0.001）,，中位生存期延長(zhǎng)至38天（對(duì)照組21天）,。

脾細(xì)胞中抗原特異性CD8?T細(xì)胞比例提高至14.2±2.8%（未修飾組5.1±1.3%）。

2.3 機(jī)制解析：TLR信號(hào)通路抑制與抗原呈遞增強(qiáng)

修飾RNA使TLR7/8通路關(guān)鍵接頭蛋白MyD88表達(dá)下調(diào)40%,，NF-κB活性降低62%,。

RNA穩(wěn)定性提升使抗原表達(dá)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)至72小時(shí)（未修飾組24小時(shí)）,。

討論

m1Ψ修飾通過(guò)雙重機(jī)制優(yōu)化DC疫苗功能：一方面降低TLR介導(dǎo)的免疫原性，避免DC過(guò)早凋亡,；另一方面延長(zhǎng)抗原表達(dá)時(shí)間,，促進(jìn)CD8?T細(xì)胞交叉激活。威尼德電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染技術(shù)（＞70%效率）為實(shí)驗(yàn)成功提供了關(guān)鍵保障,。未來(lái)需進(jìn)一步探索不同修飾模式的組合效應(yīng)及臨床級(jí)生產(chǎn)工藝的適配性,。

結(jié)論

RNA化學(xué)修飾可有效增強(qiáng)DC腫瘤疫苗的抗原呈遞能力與體內(nèi)抗腫瘤活性。本研究建立的修飾策略與評(píng)價(jià)體系為個(gè)體化疫苗開(kāi)發(fā)提供了新思路,，同時(shí)驗(yàn)證了威尼德系列儀器在RNA疫苗制備中的穩(wěn)定性和適用性,。

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