LNP促進mRNA在眼部前房的遞送與基因表達和編輯

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司 2025年03月20日 14:48

眼部前段疾病是全球?qū)е乱暳p害和失明的主要原因之一,，其中白內(nèi)障,、青光眼和視網(wǎng)膜疾病尤為突出,。這些疾病嚴重影響患者的生活質(zhì)量,，且治療手段有限。近年來，基因治療作為一種新興的治療方法，在眼部疾病治療中展現(xiàn)出巨大潛力。脂質(zhì)納米顆粒作為非病毒載體,，具有高效,、安全、生物相容性好等優(yōu)點,，在眼部基因治療中受到廣泛關(guān)注,。本研究旨在探索LNP介導的mRNA遞送在眼部前房基因表達和編輯中的應用，為眼部前段疾病的治療提供新的思路,。

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在視網(wǎng)膜疾病的基因治療領域顯示出巨大潛力,。本研究旨在擴展LNP的應用，探索通過前房內(nèi)注射（IC）途徑將LNP介導的mRNA遞送至眼部前房,，以實現(xiàn)基因表達和編輯,。研究結(jié)果顯示，IC注射LNP可促進蛋白表達和基因編輯,，且未觀察到眼部毒性,，表明IC注射LNP的安全性。本研究為LNP在眼部前房疾病治療中的應用提供了有力證據(jù),。

圖一,、示意圖

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材料與方法

LNP制備：采用離子化脂質(zhì)、輔助脂質(zhì),、膽固醇和聚乙二醇化脂質(zhì)制備LNP,，封裝mRNA。
動物模型：選用Ai9小鼠和C57BL/6小鼠作為實驗動物,。
前房內(nèi)注射：通過顯微注射技術(shù)將LNP注射至小鼠眼部前房,。
基因表達和編輯檢測：采用熒光顯微鏡、免疫組化和高通量測序等技術(shù)檢測基因表達和編輯效率,。

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結(jié)果

2.1 LNP的制備與表征：

本研究中,，我們使用微流控混合法制備了封裝有Cre-重組酶mRNA、mCherry mRNA或Cas9 mRNA-sgRNA的LNP,。LNP的制備包括將mRNA溶于檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.0）作為水相,，而將LP01/DSPC/膽固醇/DMG-PEG2k溶于乙醇作為有機相，摩爾比為50/10/38.5/1.5,。制備的LNP用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）稀釋后用于注射,。LNP的表征顯示其粒徑均勻，封裝效率高,，且穩(wěn)定性良好,，為后續(xù)的體內(nèi)實驗提供了基礎,。

圖二、LNP的表征

2.2 LNP在前房的mRNA遞送與蛋白表達：

為了評估LNP在前房的轉(zhuǎn)染效果,，我們首先使用封裝有Cre-mRNA的LNP對Ai9小鼠進行IC注射,。Ai9小鼠是一種報告基因小鼠，其基因組中整合了loxP位點兩側(cè)的tdTomato基因,，當Cre酶存在時,，loxP位點間的序列會被切除，從而激活tdTomato基因的表達,。結(jié)果顯示,，IC注射后1周，通過共聚焦顯微鏡觀察到角膜內(nèi)皮和虹膜角膜角處出現(xiàn)強烈的tdTomato熒光信號,，表明Cre-mRNA成功遞送并被翻譯成Cre酶,，進而實現(xiàn)了基因重組。

隨后,，我們使用封裝有mCherry-mRNA的LNP對C57BL/6小鼠進行IC注射,，以評估LNP在前房組織的蛋白表達情況。mCherry是一種紅色熒光蛋白,，其表達依賴于mCherry mRNA的攝取和翻譯,。結(jié)果顯示，注射后72小時,，虹膜角膜角處的小梁網(wǎng)（TM）組織出現(xiàn)強烈的mCherry熒光信號,，且該信號在注射后120小時內(nèi)逐漸減弱。這一結(jié)果表明,，LNP能夠選擇性地將mRNA遞送至TM組織,，并實現(xiàn)局部蛋白表達。

圖三,、TdTomato在虹膜角膜角的表達（由Cre LNP轉(zhuǎn)染后）

圖四,、LNP介導的mCherry在虹膜角膜角的表達

2.3 LNP介導的基因編輯：

最后，我們制備了封裝有Cas9 mRNA和sgAi9 guide RNA的LNP,，以探索在前房組織中的基因編輯效果,。sgAi9是一種針對Ai9小鼠中floxed-stop密碼子的sgRNA，能夠引導Cas9酶切割該位點,，從而激活tdTomato基因的表達,。結(jié)果顯示，IC注射后,，通過共聚焦顯微鏡觀察到虹膜角膜角處出現(xiàn)強烈的tdTomato熒光信號,，且該信號隨著注射劑量的增加而增強。這表明Cas9-sgAi9 LNP成功遞送并被翻譯成Cas9酶和sgRNA，進而實現(xiàn)了基因編輯,。

圖五,、Cas9-sgAi9 LNP注射后虹膜角膜角的基因編輯

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討論

本研究成功證明了LNP介導的mRNA遞送在眼部前房基因表達和編輯中的應用潛力。LNP作為非病毒載體,，具有高效,、安全、生物相容性好等優(yōu)點,，在眼部基因治療中展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢,。通過前房內(nèi)注射途徑，LNP能夠直接將mRNA遞送至目標組織,，實現(xiàn)局部高濃度的藥物暴露,，從而提高治療效果,。此外,，LNP還具有良好的生物屏障穿透能力，能夠克服眼部組織對藥物的吸收障礙,。然而,，本研究仍存在一些局限性。例如,，LNP在體內(nèi)的分布和代謝機制尚不充分清楚,，需要進一步深入研究。此外,，雖然本研究未觀察到眼部毒性,，但長期安全性仍需進一步評估。

參考文獻：Vasudevan, Aishwarya, et al. "Lipid nanoparticle-mediated intracameral mRNA delivery facilitates gene expression and editing in the anterior chamber of the eye." Journal of Controlled Release 379 (2025): 1022-1028.

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