摘要

多藥耐藥基因（MDR1）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）,，探索其耐藥性增強(qiáng)機(jī)制及臨床應(yīng)用潛力,。實驗采用電穿孔技術(shù)實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染，并通過體外耐藥性評估和動物模型驗證功能,。結(jié)果顯示,，轉(zhuǎn)染后CIK細(xì)胞對化療藥物的耐受性顯著提升，同時維持抗腫瘤活性,。研究為優(yōu)化腫瘤聯(lián)合治療方案提供了實驗依據(jù),。

引言

腫瘤化療的療效常因多藥耐藥性（MDR）而受限，MDR1基因編碼的P-糖蛋白可通過外排藥物降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）作為一種過繼性免疫治療手段,，在實體瘤治療中展現(xiàn)潛力，但其對化療藥物的敏感性限制了與化療的聯(lián)合應(yīng)用,。通過基因編輯技術(shù)賦予CIK細(xì)胞耐藥性,，可能突破這一瓶頸。

MDR1基因為靶點,，利用電穿孔技術(shù)將其轉(zhuǎn)染至CIK細(xì)胞,，系統(tǒng)評估轉(zhuǎn)染效率、耐藥性變化及細(xì)胞功能,，并通過動物模型驗證其協(xié)同化療的可行性,，旨在為臨床聯(lián)合治療策略提供新思路。

1. 實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與CIK細(xì)胞擴(kuò)增
人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）經(jīng)密度梯度離心分離后,，使用含重組人IFN-γ,、IL-2及抗CD3單抗的某試劑培養(yǎng)體系誘導(dǎo)CIK細(xì)胞擴(kuò)增，每日觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖狀態(tài),，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞比例,。

1.2 MDR1基因載體構(gòu)建
采用PCR擴(kuò)增MDR1基因全長序列，克隆至慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1,，經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀完成載體線性化,。通過測序驗證載體構(gòu)建正確性。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞
取對數(shù)生長期CIK細(xì)胞,，重懸于電穿孔緩沖液,，與MDR1載體混合后加入威尼德電穿孔儀，參數(shù)設(shè)置為電壓300 V,、脈沖時長10 ms,。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時，熒光顯微鏡觀察ZsGreen1表達(dá),，流式細(xì)胞術(shù)計算轉(zhuǎn)染效率,。

1.4 耐藥性功能評估
體外實驗：將轉(zhuǎn)染組（MDR1-CIK）與未轉(zhuǎn)染組（Control-CIK）分別暴露于梯度濃度阿霉素（0.1–10 μM）或紫杉醇（1–100 nM），CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）,。
分子機(jī)制分析：Western blot檢測P-糖蛋白表達(dá),；羅丹明123滯留實驗評估藥物外排功能。

1.5 抗腫瘤活性檢測
采用共培養(yǎng)體系評估MDR1-CIK對K562白血病細(xì)胞或A549肺癌細(xì)胞的殺傷效率（效靶比10:1）,，乳酸脫氫酶（LDH）釋放法量化細(xì)胞毒性,。

1.6 動物模型驗證
建立BALB/c裸鼠A549肺癌移植瘤模型，隨機(jī)分為四組：對照組,、單用阿霉素組,、單用MDR1-CIK組、聯(lián)合治療組,。監(jiān)測腫瘤體積變化及小鼠生存期,，免疫組化分析腫瘤組織凋亡標(biāo)志物（Caspase-3）。

2. 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率與P-糖蛋白表達(dá)
電穿孔法轉(zhuǎn)染效率達(dá)85.3±4.2%,，Western blot顯示MDR1-CIK中P-糖蛋白表達(dá)較對照組升高6.8倍（*p<0.01）,。

2.2 耐藥性增強(qiáng)
MDR1-CIK對阿霉素的IC50為8.2±0.7 μM，較對照組（1.5±0.3 μM）顯著提高（*p<0.001）,；羅丹明123滯留率降低62%,，證實藥物外排功能增強(qiáng)。

2.3 抗腫瘤活性維持
MDR1-CIK對K562和A549細(xì)胞的殺傷率分別為78.4±5.1%和65.2±4.8%,，與對照組無顯著差異（p>0.05）,，表明基因轉(zhuǎn)染未影響效應(yīng)功能。

2.4 動物模型療效
聯(lián)合治療組腫瘤體積較單用阿霉素組減少58.3%（*p<0.01）,，生存期延長42%,。免疫組化顯示聯(lián)合組腫瘤組織Caspase-3陽性率升高3.2倍。

討論

MDR1基因轉(zhuǎn)染可顯著提升CIK細(xì)胞耐藥性,，其機(jī)制與P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排相關(guān),，且不影響細(xì)胞毒性功能。動物實驗中,，MDR1-CIK與化療的協(xié)同效應(yīng)為臨床轉(zhuǎn)化提供了依據(jù),。

需關(guān)注的是，基因轉(zhuǎn)染可能引發(fā)基因組不穩(wěn)定性,，后續(xù)需通過威尼德分子雜交儀進(jìn)行長期安全性評估,。此外，耐藥基因的時效性及體內(nèi)微環(huán)境對其表達(dá)的影響仍需進(jìn)一步探索,。

結(jié)論

MDR1基因轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞可有效增強(qiáng)其化療耐藥性，同時保留抗腫瘤活性,，為腫瘤免疫-化療聯(lián)合治療提供了新策略,。未來需推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化制備工藝及大規(guī)模臨床試驗驗證其安全性。

參考文獻(xiàn)

1. 高瑞,肖蘭,王澤華.MDR1及MDR3基因沉默對紫杉醇耐藥細(xì)胞株A2780/Taxol凋亡能力的影響[J].實用婦產(chǎn)科雜志.2008,(8).DOI:10.3969/j.issn.1003-6946.2008.08.010 .

2. 李惠芳,楊永紅,石永進(jìn),等.Cytokine-induced killer cells showing multidrug resistance and remaining cytotoxic activity to tumor cells after transfected with mdr1 cDNA[J].中華醫(yī)學(xué)雜志（英文版）.2004,(9).

3. 任歡,邢淑賢,徐紅薇,等.CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實驗研究[J].中國腫瘤生物治療雜志.1999,(1).17-21.

4. 夏家輝, 李麓蕓著. 染色體病 [M].科學(xué)出版社,1989.

5. Linn YC,Hui KM.Cytokine-induced killer cells: NK-like T cells with cytotolytic specificity against leukemia.[J].Leukemia & lymphoma.2003,44(9).

6. Finke S,Heuft HG,Dorbic T,等.Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma.[J].The British journal of cancer.1999,81(6).