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在miRNA 的研究中經(jīng)常會涉及到miRNA 與基因靶向關(guān)系的驗證,，miRNA 通過其種子序列（5’端第2-8 個堿基）靶向結(jié)合mRNA 的3’UTR 區(qū)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)沉默復(fù)合體介導(dǎo)的mRNA降解或阻遏mRNA 的翻譯過程,?；谝陨显恚鐖D,，將目的基因3'UTR 區(qū)（或結(jié)合位點下游500bp）插入到熒光素酶報告基因載體luciferase 下游,，與miRNA mimics 共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，加入底物,，檢測熒光素酶活性的變化,。若熒光素酶活性下調(diào)，則該miRNA 與靶基因3'UTR 區(qū)存在相互作用,。
常用載體：PGL3-CMV-LUC-MCS
圖1.miRNA與3‘UTR報告基因原理示意圖
雙熒光素酶報告基因檢測用于驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用的工作原理主要基于以下幾個步驟：
miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測
利用生物信息學(xué)分析軟件（如TargetScan,、StarBase和miRanda等）來分析特定靶基因的3'-UTR區(qū)序列是否有miRNA結(jié)合位點。
將預(yù)測能夠與miRNA結(jié)合的靶基因3'-UTR序列插入載體中螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）的3'-UTR,。當(dāng)miRNA和質(zhì)粒中的插入序列結(jié)合后,，miRNA會通過和所插入的序列結(jié)合從而抑制螢火蟲熒光素酶的翻譯,，最終造成熒光值的降低,。
miRNA/靶基因間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗證
miRNA與靶基因的作用機制
實驗步驟
結(jié)果分析
通過上述步驟，雙熒光素酶報告基因檢測可以有效地驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用,，為研究miRNA的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要工具,。
翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù)流程：
詳細(xì)操作步驟：
材料與準(zhǔn)備
細(xì)胞HEK 293 細(xì)胞或目的細(xì)胞
轉(zhuǎn)染試劑：可選Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑（貨號：40806ES）
報告基因檢測試劑盒：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：11402ES）
其他儀器耗材酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)板等
實驗步驟
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實驗
當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗證實驗時,，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率,，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時表明預(yù)實驗通過,。
轉(zhuǎn)染正式實驗
a. 將狀態(tài)良好,，處于對數(shù)生長期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液,，細(xì)胞計數(shù)后,，接種于24 孔培養(yǎng)板中；
b. 培養(yǎng)過夜,，觀察細(xì)胞生長狀態(tài),。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗,；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基,；
d. 轉(zhuǎn)染取無菌的1.5 mL EP 管，轉(zhuǎn)染參考轉(zhuǎn)染試劑使用說明書；
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品,。
A 細(xì)胞樣品收集
a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞,，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次,；
b. 棄去PBS,，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；
c. 細(xì)胞裂解后,，將樣品轉(zhuǎn)移入EP 管中,，-80 度冰箱保存。
B 根據(jù)報告基因檢測試劑盒說明書操作進(jìn)行檢測
a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物,，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min,。離心后將上清液移入新的
EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測。
b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量,，將Renilla Luciferase Assay
Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer,，混勻后室溫放置。
c. 熒光素酶檢測
按照儀器說明書要求將熒光檢測打開,，設(shè)定參數(shù),，測定時間為10 s，測定間隔為2 s,；
將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致）,，
另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后
測定RLU（Relative light unit）,，同時設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對照孔,；
將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次,，充分
混勻后測定RLU,，同時設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。
常規(guī)檢測分組
（1）mimics NC+對照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK),；
（2）mimics NC+ 3’UTR 野生型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK）；
（3）mimics NC+ 3’UTR 突變型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK),；
（4）mimics+對照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK),；
（5）mimics+3’UTR 野生型質(zhì)粒（WT）+海腎內(nèi)參（TK)；
（6）mimics+3’UTR 突變型質(zhì)粒（MT）+海腎內(nèi)參（TK),。
實驗預(yù)期結(jié)果
翌圣可提供雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù),，加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進(jìn)度
相關(guān)產(chǎn)品清單：
產(chǎn)品類別 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
雙熒光素酶報告基因檢測試劑 | Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11402ES60/80 | 100T/1000T |
Dual One Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11405ES60/80 | 100T/1000T | |
轉(zhuǎn)染試劑 | Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES01/03 | 100μL/1mL |
Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES01/02/03 | 0.1mL/0.5mL /1mL | |
Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40809ES01/03 | 0.1mL/1mL |
相關(guān)產(chǎn)品
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