賽默飛熒光定量PCR儀注意事項(xiàng)
賽默飛熒光定量PCR儀(如QuantStudio系列)**時(shí)應(yīng)注意的關(guān)鍵事項(xiàng),,涵蓋設(shè)備使用、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,、數(shù)據(jù)分析,、安全等方面:
一,、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段
樣本與試劑準(zhǔn)備
樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融,保持RNA/DNA質(zhì)量,。
所有試劑應(yīng)解凍并混勻后再使用,。
使用低吸附管或PCR專用耗材,減少吸附損失,。
反應(yīng)體系設(shè)置
嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)配制體系,,注意引物、探針濃度,。
使用去RNA酶/去DNA酶的無(wú)核酸水配制,。
配置時(shí)操作應(yīng)在冰上進(jìn)行,避免酶活性變化,。
加樣操作
避免氣泡,,影響熒光讀數(shù)。
封板前輕輕離心,,確保液體在孔底,。
使用光學(xué)封板膜,確保貼合緊密,、無(wú)褶皺,。
二、儀器操作階段
PCR板放置
保持板底清潔,,避免灰塵,、水漬影響檢測(cè)。
板放入儀器前注意方向正確,,與軟件板圖一致,。
通道設(shè)定
選擇與試劑染料匹配的熒光通道。
若為多重檢測(cè),,確保熒光染料無(wú)通道重疊,。
擴(kuò)增程序設(shè)置
根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)定溫度和循環(huán)參數(shù)。
通常熒光采集設(shè)在延伸階段,。
熔解曲線(如SYBR Green)
啟用熔解曲線分析可判斷擴(kuò)增特異性,。
單一峰形代表反應(yīng)特異性良好,。
三、數(shù)據(jù)分析階段
Ct值判斷
Ct值過(guò)高(>35)應(yīng)考慮模板濃度,、污染或反應(yīng)效率問(wèn)題,。
無(wú)模板對(duì)照應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線,否則懷疑污染,。
擴(kuò)增曲線觀察
正常擴(kuò)增曲線呈“S”型,。
曲線不規(guī)則或漂移可能因加樣誤差或設(shè)備問(wèn)題。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析(絕對(duì)定量)
R2值應(yīng)接近1,,擴(kuò)增效率在90–110%之間較理想,。
四、安全與維護(hù)
設(shè)備清潔
加熱模塊表面需定期擦拭,。
避免液體流入樣本槽,,若有泄漏立即處理。
避免交叉污染
區(qū)分模板制備區(qū)與擴(kuò)增區(qū),。
使用過(guò)濾吸頭,,勤更換手套。
試劑儲(chǔ)存
酶類試劑儲(chǔ)存于-20℃,,避免頻繁凍融,。
染料類避光保存,使用后立即蓋緊,。
數(shù)據(jù)備份
定期導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),,避免軟件崩潰造成丟失。
軟件升級(jí)前應(yīng)先備份方法與結(jié)果文件,。
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