摘要

轉染SCF基因至NK細胞系,，探討其對細胞增殖,、細胞毒性及遷移能力的影響,。采用威尼德電穿孔儀完成基因導入,，結合流式細胞術,、CCK-8法和Transwell實驗評估功能變化。結果顯示,，SCF轉染顯著增強NK細胞增殖活性（p<0.05）,，細胞毒性提高23%，遷移能力提升1.8倍,。Western blot證實SCF過表達激活PI3K/AKT通路,。本研究為優(yōu)化NK細胞免疫治療提供了理論支持。

引言

自然殺傷（NK）細胞作為先天免疫系統的重要組成部分,，在腫瘤免疫監(jiān)視和抗病毒感染中發(fā)揮關鍵作用,。然而，NK細胞在體外擴增效率低,、存活時間短等問題限制了其臨床應用,。干細胞因子（SCF）是一種多功能細胞因子，通過與c-Kit受體結合,，參與造血干細胞存活,、增殖及遷移的調控。前期研究表明,，SCF可增強T細胞和造血干細胞的活性,，但其在NK細胞中的功能尚未明確。

近年來,，基因編輯技術的進步為免疫細胞功能改造提供了新思路,。通過轉染外源基因調控NK細胞的生物學特性，有望突破其應用瓶頸,。本研究以人源NK細胞系（NK-92）為模型,，構建SCF過表達載體，利用威尼德電穿孔儀實現高效轉染,，系統評估SCF基因對NK細胞增殖,、殺傷功能及遷移能力的影響，并初步探索其分子機制,，旨在為基于NK細胞的免疫治療提供新策略,。

實驗部分

1. 細胞培養(yǎng)與預處理
NK-92細胞使用含10%胎牛血清（某試劑）、100 U/mL青霉素-鏈霉素（某試劑）的RPMI-1640培養(yǎng)基（某試劑）,，于37℃,、5% CO?條件下懸浮培養(yǎng),。每48小時更換新鮮培養(yǎng)基，細胞密度維持在1×10?/mL,。實驗前24小時,，將細胞接種于6孔板（某品牌），密度調整為5×10?/mL,。

2. 質粒構建與病毒包裝
SCF基因編碼序列（NCBI登錄號：NM_000899.3）通過PCR擴增,，克隆至慢病毒載體pLVX-IRES-Puro（某試劑）。使用威尼德分子雜交儀進行載體線性化,，并通過脂質體法（某試劑）轉染HEK293T細胞（某試劑）,，收集48小時后的病毒上清，離心濃縮后測定滴度（1×10? TU/mL）,。

3. SCF基因轉染與篩選
取對數生長期NK-92細胞,，以MOI=20感染慢病毒，同時設置空載體對照組,。轉染后24小時,，更換含2 μg/mL嘌呤霉素（某試劑）的培養(yǎng)基進行篩選，持續(xù)7天,。采用威尼德紫外交聯儀檢測轉染效率,，流式細胞術（某品牌）分析SCF蛋白表達，確認轉染成功率＞85%,。

4. 細胞增殖能力分析
采用CCK-8法（某試劑）評估SCF轉染對增殖的影響,。將對照組和SCF轉染組細胞（1×10?/孔）接種至96孔板（某品牌），分別于0,、24,、48、72小時加入10 μL CCK-8試劑,，37℃孵育2小時后,，使用酶標儀（某品牌）測定450 nm吸光度，繪制生長曲線,。

5. 細胞毒性檢測
以K562白血病細胞為靶細胞,，按效靶比（E:T）10:1、20:1,、40:1分別與NK細胞共培養(yǎng)4小時,。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法（某試劑）定量細胞毒性：收集上清，加入LDH底物反應30分鐘,，測定490 nm吸光度,，計算殺傷率。公式：殺傷率（%）=（實驗組OD?自發(fā)釋放OD）/（最大釋放OD?自發(fā)釋放OD）×100%,。

6. 細胞遷移能力評估
Transwell實驗（某試劑）檢測SCF對遷移的影響,。上室加入200 μL無血清細胞懸液（5×10?/mL）,，下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時,。移除上室細胞,，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色,，某品牌倒置顯微鏡隨機選取5視野計數遷移細胞數,。

7. 凋亡與周期分析
采用Annexin V-FITC/PI雙染法（某試劑）檢測細胞凋亡。收集1×10?細胞,，PBS洗滌后加入結合緩沖液和熒光染料，避光孵育15分鐘,，流式細胞儀（某品牌）分析凋亡率,。細胞周期檢測采用PI染色法：70%乙醇固定過夜，RNase A處理后PI染色30分鐘,，流式檢測G0/G1,、S、G2/M期比例,。

8. 分子機制研究
Western blot分析PI3K/AKT通路蛋白表達,。提取細胞總蛋白（某試劑），BCA法定量后上樣30 μg,，SDS-PAGE電泳轉膜,，5%脫脂牛奶封閉1小時，加入PI3K,、p-AKT（Ser473）,、AKT一抗（某試劑）4℃孵育過夜。TBST洗滌后加入HRP標記二抗（某試劑）,，威尼德紫外交聯儀顯影,，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

9. 統計學分析
實驗數據以均值±標準差表示,，采用某品牌統計軟件進行t檢驗或單因素方差分析,，p<0.05為差異顯著。

結論

SCF基因轉染可顯著提升NK-92細胞的增殖,、細胞毒性和遷移能力,，其機制可能與PI3K/AKT信號通路的激活相關。研究結果為NK細胞的體外功能優(yōu)化提供了新方向,，具有潛在的臨床應用價值,。

參考文獻

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