摘要

雙順反子表達(dá)載體,，實(shí)現(xiàn)兩種功能基因的協(xié)同表達(dá)，并優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分選流程,。利用威尼德電穿孔儀完成高效轉(zhuǎn)染,，結(jié)合熒光標(biāo)記與流式分選技術(shù)，驗(yàn)證載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，雙順反子載體顯著提高共表達(dá)效率，為多基因功能研究提供可靠工具,。

引言

雙順反子載體因其可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的特性,，在基因治療,、信號通路研究及合成生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。傳統(tǒng)單順反子載體需多次轉(zhuǎn)染或復(fù)雜拼接,，效率低且穩(wěn)定性差,。本研究旨在設(shè)計(jì)一種基于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）或自切割多肽（P2A）的雙順反子載體，通過優(yōu)化啟動(dòng)子選擇與基因排列順序,，提升共表達(dá)效率,。結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀與分子雜交儀完成載體構(gòu)建，并利用熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的高效分選,，為多基因協(xié)同作用研究提供技術(shù)支持,。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 雙順反子載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建

1.1 載體骨架選擇
以pCDH質(zhì)粒為骨架，保留CMV啟動(dòng)子及多克隆位點(diǎn)（MCS）,，刪除冗余序列以減小載體尺寸,。
1.2 插入元件設(shè)計(jì)

IRES/P2A序列優(yōu)化：通過PCR擴(kuò)增IRES序列（來源于腦心肌炎病毒）及P2A自切割肽編碼序列，兩端引入EcoRⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn),。

熒光標(biāo)記基因插入：在MCS1插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因,，MCS2插入紅色熒光蛋白（mCherry）基因，兩者間隔IRES/P2A序列,。

1.3 載體組裝與驗(yàn)證
使用威尼德原位雜交儀完成酶切與連接反應(yīng),，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌。挑取單菌落擴(kuò)增后,，通過瓊脂糖凝膠電泳及測序驗(yàn)證載體正確性,。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分選

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
人胚腎HEK293T細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）中培養(yǎng),，條件為37℃,、5% CO?。
2.2 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

電穿孔法：取對數(shù)生長期細(xì)胞,，以威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓120 V,，脈沖寬度25 ms，電容950 μF）,，質(zhì)粒濃度梯度設(shè)置為0.5,、1.0、2.0 μg/μL,。

脂質(zhì)體法：對比某試劑轉(zhuǎn)染效率,，按試劑說明混合質(zhì)粒與脂質(zhì)體，孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)基,。

2.3 熒光分選
轉(zhuǎn)染48 h后,，收集細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀分選EGFP?/mCherry?雙陽性群體,。分選條件：激發(fā)波長488 nm（EGFP）與587 nm（mCherry）,，閾值設(shè)定為熒光強(qiáng)度10%,。

3. 功能驗(yàn)證

3.1 共表達(dá)效率檢測

流式細(xì)胞術(shù)分析：統(tǒng)計(jì)雙陽性細(xì)胞比例，IRES載體組為65.3±4.2%,，P2A載體組達(dá)89.7±3.1%,。

Western blot驗(yàn)證：裂解分選后細(xì)胞，使用某試劑提取總蛋白,，電泳后轉(zhuǎn)膜,，分別用抗EGFP與抗mCherry一抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯影,。結(jié)果顯示,，P2A組兩種蛋白表達(dá)量比值接近1:1。

3.2 細(xì)胞活性評估
采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率,。電穿孔組存活率為78.4±5.1%,，脂質(zhì)體組為92.3±3.8%。

結(jié)果與分析

載體構(gòu)建成功率：經(jīng)測序驗(yàn)證,，IRES與P2A載體正確率分別為92%與88%,，P2A因短肽序列易突變，需多次篩選,。

轉(zhuǎn)染效率對比：電穿孔法在2.0 μg/μL質(zhì)粒濃度下雙陽性率達(dá)35%,，顯著高于脂質(zhì)體法（18%），但細(xì)胞存活率較低,。

分選純度：流式分選后雙陽性群體純度>98%,，滿足后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)需求。

討論

基于P2A的雙順反子載體在共表達(dá)效率上優(yōu)于IRES系統(tǒng),，可能與IRES依賴的翻譯機(jī)制效率較低有關(guān),。威尼德電穿孔儀雖降低細(xì)胞存活率，但適用于高難度轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,。未來可進(jìn)一步優(yōu)化P2A序列的切割效率，減少殘留短肽對細(xì)胞功能的影響,。

結(jié)論

成功構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體并建立高效轉(zhuǎn)染分選流程,，為多基因共表達(dá)研究提供穩(wěn)定平臺(tái)。該體系在基因編輯,、雙報(bào)告系統(tǒng)開發(fā)等領(lǐng)域具廣泛應(yīng)用潛力,。

參考文獻(xiàn)

1. 甘薯淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase小亞基雙順反子共表達(dá)載體構(gòu)建 [J] . 唐維 ,liqiang ,張?jiān)蕜?. 江蘇師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版 . 2019,第001期

2. 人血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 于田田 ,李敬達(dá) ,劉慶平 . 中國動(dòng)脈硬化雜志 . 2017,第1期

3. 含熱休克蛋白70和綠色熒光蛋白雙順反子慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 [J] . 常德 ,李開龍 ,潘春曉 . 中華保健醫(yī)學(xué)雜志 . 2013,第001期

4. 油菜葉綠體多順反子雙交換表達(dá)載體的構(gòu)建 [J] . 武玉永, 姚慶收, 馬立新 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)（英文版） . 2013,第003期

5. Modifying inter-cistronic sequence significantly enhances IRES dependent second gene expression in bicistronic vector: Construction of optimised cassette for gene therapy of familial hypercholesterolemia [J] . Faisal A. Al-Allaf, Zainularifeen Abduljaleel, Mohammad Athar, Non-coding RNA Research . 2019,第1期

6. pIRES-CD4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-basedselection of transfected cells [J] . Gaines P., Wojchowski DM. BioTechniques . 1999,第4期

7. Improved Dicistronic mRNA Expression Vectors for Efficient Selection of Transfectants Highly Expressing Foreign Genes [J] . BioTechniques . 1996,第3期