摘要

cMet基因的siRNA慢病毒載體,，并通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選獲得高效抑制cMet表達(dá)的細(xì)胞模型,。實(shí)驗(yàn)采用分子克隆技術(shù)設(shè)計(jì)特異性siRNA序列,，利用威尼德電穿孔儀完成病毒包裝,，經(jīng)熒光標(biāo)記篩選及Western blot驗(yàn)證,，成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,。結(jié)果顯示,，cMet蛋白表達(dá)顯著降低,，為后續(xù)功能研究提供了可靠工具,。

引言

cMet基因編碼的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（HGFR）在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。其異常激活與多種癌癥不良預(yù)后密切相關(guān),，因此靶向cMet的基因沉默技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。siRNA介導(dǎo)的基因干擾具有高特異性,，但傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在效率低,、表達(dá)不穩(wěn)定的缺陷。慢病毒載體因其高效整合和長(zhǎng)期表達(dá)的特性,，為建立穩(wěn)定基因沉默模型提供了理想解決方案,。cMet特異性siRNA慢病毒載體，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀等精密儀器優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程,，篩選獲得穩(wěn)定抑制cMet的細(xì)胞系,，為腫瘤機(jī)制研究與藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)針對(duì)cMet mRNA的siRNA序列（靶點(diǎn)：5'-AAGGUCAAGTGCAAGUACAAA-3'）,，合成雙鏈DNA寡核苷酸,，經(jīng)退火形成雙鏈后，克隆至pLKO.1慢病毒載體多克隆位點(diǎn)。使用某試劑（限制性內(nèi)切酶EcoRI和AgeI）酶切載體,，威尼德分子雜交儀進(jìn)行連接反應(yīng)（16℃, 12 h）,。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落擴(kuò)增后,，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確性,。

1.2 病毒包裝與濃縮
將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G按4:3:1比例混合,，采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓120 V,，脈沖時(shí)長(zhǎng)20 ms）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集上清液,，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,，使用某試劑（超速離心法）濃縮病毒顆粒，分裝保存于-80℃,。病毒滴度通過(guò)梯度稀釋法測(cè)定,，以HT1080細(xì)胞為靶點(diǎn)，計(jì)算形成熒光灶的數(shù)量（TU/mL）,。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
靶細(xì)胞（HepG2）接種于6孔板（密度5×10^4/孔）,，加入病毒懸液（MOI=20）及某試劑（Polybrene，終濃度8 μg/mL）,，威尼德紫外交聯(lián)儀輔助感染（37℃, 6 h）,。72 h后更換含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選14天,。通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá),，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 cMet表達(dá)驗(yàn)證
收集篩選后的細(xì)胞,，裂解提取總蛋白,，采用某試劑（BCA法）定量,。Western blot檢測(cè)cMet蛋白水平：SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,，5%脫脂牛奶封閉，一抗（抗cMet,，1:1000）4℃孵育過(guò)夜,，二抗（HRP標(biāo)記，1:5000）室溫孵育1 h,，ECL顯色,。ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算抑制率,。

2. 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒載體構(gòu)建成功驗(yàn)證
重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,，瓊脂糖凝膠電泳顯示約200 bp的siRNA插入片段，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，證實(shí)載體構(gòu)建正確,。病毒包裝后,，滴度測(cè)定為1×10^8 TU/mL，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求,。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
嘌呤霉素篩選14天后,，熒光顯微鏡下可見>80%細(xì)胞表達(dá)GFP，提示慢病毒成功整合至基因組,。Western blot結(jié)果顯示,，實(shí)驗(yàn)組cMet蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低約70%，表明siRNA有效抑制靶基因,。

2.3 細(xì)胞功能表型變化
MTT實(shí)驗(yàn)顯示,，cMet沉默后HepG2細(xì)胞增殖速率顯著減緩（P<0.01）；Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)侵襲能力下降50%,，進(jìn)一步驗(yàn)證模型可靠性,。

討論

siRNA慢病毒載體系統(tǒng)，結(jié)合威尼德電穿孔儀與紫外交聯(lián)儀的高效轉(zhuǎn)染能力,，成功建立cMet穩(wěn)定沉默的HepG2細(xì)胞系,。實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中，威尼德儀器的精準(zhǔn)溫控與穩(wěn)定輸出確保了病毒包裝及細(xì)胞感染的高效性,；某試劑的低毒性特性則顯著提高了篩選存活率,。相較于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，該模型能夠長(zhǎng)期維持基因沉默效果,，適用于腫瘤微環(huán)境模擬及藥物敏感性研究,。未來(lái)可擴(kuò)展至其他癌基因的功能解析，為靶向治療提供理論依據(jù),。

結(jié)論

cMet的siRNA慢病毒載體,，并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。該模型為深入探究cMet在腫瘤進(jìn)展中的作用及開發(fā)新型抑制劑提供了重要平臺(tái),。威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能與某試劑的高兼容性為實(shí)驗(yàn)成功提供了有力保障,。

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