人CD160基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究
摘要:
分子克隆技術(shù)構(gòu)建人CD160基因過(guò)表達(dá)載體,,利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T及Jurkat細(xì)胞系,篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移模型系統(tǒng)分析CD160對(duì)細(xì)胞增殖,、凋亡及遷移能力的影響。結(jié)果顯示CD160過(guò)表達(dá)顯著抑制T淋巴細(xì)胞活化并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移,,Western blot證實(shí)其通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用,,為免疫調(diào)控機(jī)制研究提供新模型。
引言:
CD160作為免疫球蛋白超家族成員,,在T/B淋巴細(xì)胞表面特異性表達(dá),,參與共刺激信號(hào)傳遞和免疫應(yīng)答調(diào)控。近年研究表明,,CD160在腫瘤微環(huán)境中呈現(xiàn)差異性表達(dá)特征,,但其分子機(jī)制尚未闡明。本研究針對(duì)CD160基因功能研究的技術(shù)瓶頸,,通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,,結(jié)合多維度功能驗(yàn)證體系,系統(tǒng)解析該基因在免疫調(diào)控和腫瘤進(jìn)展中的雙重作用,,為開(kāi)發(fā)靶向免疫檢查點(diǎn)治療策略提供理論依據(jù),。
材料與方法:
1. 基因克隆與載體構(gòu)建
采用PCR擴(kuò)增獲得人CD160全長(zhǎng)編碼序列(NCBI登錄號(hào):NM_007053),引物設(shè)計(jì)引入BamHI/XhoI酶切位點(diǎn),。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3.1(+)載體(某試劑)經(jīng)威尼德分子雜交儀進(jìn)行定向連接,,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
選取HEK293T(人胚腎細(xì)胞)和Jurkat(人T淋巴細(xì)胞)作為宿主細(xì)胞,,使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,,參數(shù)設(shè)置為:電壓220V,,脈沖時(shí)間15ms。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入含800μg/mL G418(某試劑)的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行為期3周的穩(wěn)定株篩選,。采用流式細(xì)胞術(shù)(某試劑)檢測(cè)CD160表面表達(dá)率,,篩選陽(yáng)性率>90%的細(xì)胞亞群進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3. 功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
(1)細(xì)胞增殖:CCK-8法連續(xù)監(jiān)測(cè)5天,,設(shè)置6復(fù)孔/組,,威尼德酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度
(2)凋亡分析:Annexin V-FITC/PI雙染法(某試劑),流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期/晚期凋亡比例
(3)遷移能力:Transwell小室(8μm孔徑)裝載5×10^4細(xì)胞,,6小時(shí)后棉簽擦除未遷移細(xì)胞,,結(jié)晶紫(某試劑)染色后顯微計(jì)數(shù)
(4)信號(hào)通路檢測(cè):RIPA裂解液(某試劑)提取總蛋白,BCA法定量后,,Western blot檢測(cè)PI3K,、p-AKT、Bcl-2等關(guān)鍵分子表達(dá),。
4. 分子互作驗(yàn)證
采用威尼德紫外交聯(lián)儀(365nm,,10min)固定蛋白質(zhì)復(fù)合物,通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)驗(yàn)證CD160與HVEM受體的特異性結(jié)合,。設(shè)置IgG同型對(duì)照,,使用Protein A/G磁珠(某試劑)富集復(fù)合物后行SDS-PAGE分析。
結(jié)果:
1. 成功構(gòu)建CD160過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,,qPCR顯示轉(zhuǎn)染組mRNA水平較對(duì)照組提升38.6倍(P<0.001),,流式檢測(cè)表面蛋白陽(yáng)性率達(dá)93.2±2.4%
2. 功能實(shí)驗(yàn)顯示:CD160過(guò)表達(dá)使Jurkat細(xì)胞增殖抑制率達(dá)62.3%(72h),凋亡率增加至28.7%(vs對(duì)照8.2%),;HEK293T遷移細(xì)胞數(shù)增加2.1倍(P<0.01)
3. 信號(hào)通路分析表明:轉(zhuǎn)染組p-AKT(Ser473)磷酸化水平降低41%,,促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)3.2倍,抗凋亡蛋白Bcl-2下降56%
4. Co-IP證實(shí)CD160與HVEM在Jurkat細(xì)胞膜表面形成穩(wěn)定復(fù)合物,,交聯(lián)強(qiáng)度較對(duì)照組增強(qiáng)5.8倍
討論:
CD160過(guò)表達(dá)雙細(xì)胞模型,,成功揭示了該基因在免疫調(diào)控中的雙重角色:在T淋巴細(xì)胞中通過(guò)抑制PI3K/AKT通路促進(jìn)活化誘導(dǎo)凋亡,而在上皮源細(xì)胞中則通過(guò)重塑細(xì)胞骨架增強(qiáng)遷移能力,。這一發(fā)現(xiàn)為解釋CD160在自身免疫疾病與腫瘤轉(zhuǎn)移中的矛盾表達(dá)現(xiàn)象提供了機(jī)制基礎(chǔ),。特別值得注意的是,CD160-HVEM互作界面的鑒定為開(kāi)發(fā)小分子抑制劑提供了潛在靶點(diǎn),。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,,威尼德紫外交聯(lián)儀的穩(wěn)定輸出保障了蛋白質(zhì)交聯(lián)效率,其精確的紫外能量控制系統(tǒng)使分子互作研究更具可重復(fù)性,。
結(jié)論:
CD160基因工程細(xì)胞株,,結(jié)合多維功能分析平臺(tái),闡明其在細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控中的分子機(jī)制,。所建立的技術(shù)體系可為免疫檢查點(diǎn)相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化方案,,威尼德系列分子生物學(xué)儀器的應(yīng)用顯著提升了實(shí)驗(yàn)效率。研究結(jié)果不僅拓展了對(duì)CD160生物學(xué)功能的認(rèn)知,,更為開(kāi)發(fā)基于該靶點(diǎn)的免疫治療策略奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),。
參考文獻(xiàn)
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