ELISA檢測(cè)方法原理,、操作步驟及常見(jiàn)問(wèn)題
ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷的實(shí)驗(yàn)技術(shù),。由于其高靈敏度和具體性,ELISA已成為檢測(cè)抗體,、激素,、蛋白質(zhì)和病原體的方法。
一,、ELISA檢測(cè)原理
基本原理
方法類型
直接ELISA:使用直接標(biāo)記有酶的抗體對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè),。 間接ELISA:使用兩種抗體,第一抗體特異地識(shí)別抗原,,第二抗體識(shí)別第一抗體并標(biāo)記有酶,。 夾心ELISA:利用兩種抗體夾住抗原,其中一種固定,另一種標(biāo)記有酶,。 競(jìng)爭(zhēng)ELISA:抗原和標(biāo)記有酶的抗原競(jìng)爭(zhēng)同一抗體的結(jié)合位,。
二、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)材料
抗體:選擇高特異性和親和力的抗體,。 酶標(biāo)記底物:常用的酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP),,底物選擇應(yīng)與酶相匹配。 洗滌液:通常使用含有Tween-20的PBS緩沖液以減少非特異性結(jié)合,。 阻斷液:用于阻斷微孔板中未被抗體或抗原占據(jù)的位點(diǎn),,防止非特異性吸附。
設(shè)備與環(huán)境
酶標(biāo)儀:用于讀取酶反應(yīng)產(chǎn)生的光信號(hào),。 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境:需要保持清潔,,溫度和濕度控制適中以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
三,、操作步驟詳解
1. 樣品準(zhǔn)備
處理:取所需樣品體積,,如有必要,進(jìn)行適當(dāng)稀釋以符合測(cè)試范圍,。
存儲(chǔ):將樣品分裝在避光小管中,,存放于-20°C以下以避免降解。避免反復(fù)凍融,,建議分裝成單次使用量,。
2. 加樣與孵育
加樣:在微孔板中加入50 µL樣品到每個(gè)測(cè)試孔中。使用多通道移液器可以提高效率和準(zhǔn)確性,。
孵育:將孔板覆蓋,,放置在37°C孵育器中孵育1小時(shí),或根據(jù)抗體配套文件推薦的時(shí)間進(jìn)行孵育,。
3. 洗滌
洗滌次數(shù):用自動(dòng)洗板機(jī)或手動(dòng)洗板,,每次加入300 µL洗滌緩沖液,靜置幾秒后棄液,,重復(fù)此過(guò)程至少3次,。
洗滌技巧:確保每次洗滌液充分覆蓋孔底,避免泡沫產(chǎn)生,,因泡沫可能導(dǎo)致孔間污染,。
4. 酶標(biāo)底物加入和信號(hào)發(fā)展
底物加入:向每個(gè)孔中加入100 µL酶底物(如TMB),在避光條件下室溫孵育15-30分鐘,。
終止反應(yīng):加入50 µL的終止液(如2N硫酸),,反應(yīng)立即停止,并將顏色由藍(lán)變黃,。
5. 讀取結(jié)果
使用酶標(biāo)儀:在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值,。如果可能,,讀取650 nm作為參考波長(zhǎng),以校正板材不均或泡沫的影響,。
四,、注意事項(xiàng)與經(jīng)驗(yàn)分享
常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策
孔板交叉污染:使用新的吸頭和適當(dāng)?shù)募夹g(shù),如慢速釋放液體到孔壁,,避免液體直接沖擊到孔底,。
底物不穩(wěn)定:底物開(kāi)封后應(yīng)避光保存,并在推薦的有效期內(nèi)使用,,過(guò)期底物可能導(dǎo)致信號(hào)弱或背景高,。
經(jīng)驗(yàn)技巧
提高靈敏度:優(yōu)化底物的孵育時(shí)間,觀察顏色變化,,避免過(guò)度孵育導(dǎo)致信號(hào)飽和。
減少非特異性背景:增加阻斷步驟的時(shí)間或使用高效的阻斷劑,,如脫脂牛奶粉或BSA,,以填補(bǔ)未被抗體或抗原占據(jù)的微孔板表面。
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