使用H?/H?O?雙重激活的分子成像平臺(tái)評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤惡性程度
本文要點(diǎn):近紅外二區(qū)(NIR-II)熒光成像在腫瘤精準(zhǔn)診斷中至關(guān)重要,,具有更高的分辨率和穿透能力。然而,,現(xiàn)有的NIR-II探針要么是“常亮”模式,,要么僅響應(yīng)單一刺激,,導(dǎo)致信噪比低和潛在的假陽(yáng)性問(wèn)題,。本研究提出了一種雙鎖控制的探針HN-PBA,,通過(guò)同時(shí)響應(yīng)H?O?和腫瘤酸性環(huán)境激活熒光信號(hào),。這種雙重響應(yīng)機(jī)制確保了腫瘤部位的明亮熒光信號(hào),相較于傳統(tǒng)的“常亮”探針和僅響應(yīng)H?O?的探針,,顯著提高了腫瘤與正常組織的對(duì)比度(T/NT),。該策略能夠精準(zhǔn)識(shí)別并切除原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤,T/NT比分別達(dá)到24.3(原發(fā)灶)和6.4(肺轉(zhuǎn)移灶),。該探針還能有效檢測(cè)直徑≤0.7 mm的肺轉(zhuǎn)移灶,,并在臨床乳腺癌樣本中展示了精準(zhǔn)病灶定位的能力。這種雙重刺激響應(yīng)策略為未來(lái)診斷探針的設(shè)計(jì)提供了新思路,。
開發(fā)一種雙鎖控制的NIR-II熒光探針HN-PBA,,用于響應(yīng)酸性腫瘤微環(huán)境(酸性pH/過(guò)氧化氫(H?O?)的雙重刺激。探針有望通過(guò)NIR-II熒光成像同時(shí)提供高特異性的腫瘤識(shí)別和引導(dǎo)手術(shù),,用于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤(方案1),。探針HN-PBA設(shè)計(jì)有兩個(gè)智能“鎖”,其核心結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)功能模塊,。第一鎖:硼酸酯基團(tuán)作為H?O?響應(yīng)位點(diǎn),,通過(guò)H?O?觸發(fā)的親核反應(yīng)生成硫醇基團(tuán),增強(qiáng)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT),。第二鎖:羧酸修飾的羅丹明衍生物通過(guò)pH依賴的螺環(huán)化機(jī)制調(diào)節(jié)熒光信號(hào),。HN-PBA探針在自然狀態(tài)下顯示NIR-II熒光信號(hào)“關(guān)”。當(dāng)與兩個(gè)“鑰匙”一起開啟時(shí),,即在酸性介質(zhì)中存在H?O?時(shí),,HN-PBA的硼酸酯可以與H?O?發(fā)生親核相互作用,形成過(guò)渡中間體,,隨后水解生成酚羥基,,接著發(fā)生分子內(nèi)自消除反應(yīng)并生成具有強(qiáng)給電子特性的硫醇基團(tuán)。結(jié)果,,HN-PBA的NIR-II信號(hào)在H?/H?O?的協(xié)同作用下恢復(fù),。光譜研究表明,HN-PBA 探針在pH 6.5的酸性溶液中對(duì)H?O?表現(xiàn)出高靈敏度和特異性響應(yīng),,最大發(fā)射波長(zhǎng)為1,060 nm,。由于實(shí)體瘤環(huán)境中H?O?水平高且pH值弱酸性,HN-PBA可以選擇性地點(diǎn)亮其NIR-II熒光信號(hào),,從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的靶向成像和引導(dǎo)干預(yù),。鑒于雙鎖設(shè)計(jì)策略可以有效減少非特異性響應(yīng)和“假陽(yáng)性”信號(hào)干擾,雙刺激激活探針HN-PBA提供了比“常亮”探針I(yè)CG和單生物標(biāo)志物(H?O?)激活探針HN-PBC高8.2/4.0倍的目標(biāo)與噪聲比,。此外,,HN-PBA探針有效引導(dǎo)了多個(gè)微腫瘤的準(zhǔn)確切除,,確保最小殘留陰性切緣低至約0.25 mm。更重要的是,,HN-PBA能夠精確區(qū)分原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺病變與周圍正常組織,。在NIR-II熒光成像的輔助下,直徑約0.7 mm的微小肺轉(zhuǎn)移灶可以被有效切除,。最后,,HN-PBA在臨床腫瘤標(biāo)本的成像中表現(xiàn)出良好的特異性。
接著,,研究了HN-PBA在H+/H2O2共刺激下的光學(xué)響應(yīng),。圖1a中的吸收光譜顯示,在酸性條件下(pH 6.5), HN-PBA在628nm處的吸收下降而在825nm附近出現(xiàn)新的吸收帶,。然而在生理?xiàng)l件下(pH 7.4),在HN-PBA與H2O2的反應(yīng)過(guò)程中,,825 nm處的吸收顯著降低,,并在480 nm處觀察到新的吸收峰。推測(cè)這些新峰可能歸因于兩種形式的反應(yīng)產(chǎn)物,,即HN-PBA-SH(開環(huán),,825 nm)和HN-PBA-SS-SH-SR(螺內(nèi)酰胺,480 nm,,方案1),。在808 nm激發(fā)下,HN-PBA在1060 nm處的NIR-II熒光信號(hào)在H2O2和酸的存在下表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)(約17.1倍),。相反,,當(dāng)單獨(dú)存在H2O2(4.1倍)或酸性環(huán)境(pH=6.5,0.8倍)時(shí),,觀察到熒光信號(hào)的變化很?。▓D1b,c),。此外,,評(píng)估了HN-PBA在H2O2存在下對(duì)pH變化的可逆反應(yīng)(圖1d)。1060nm處的NIR-II信號(hào)在用不同pH介質(zhì)連續(xù)處理后表現(xiàn)出光學(xué)“開啟”到“關(guān)閉”的循環(huán),。值得注意的是,,H+/H2O2雙激活協(xié)同H+可逆反應(yīng)設(shè)計(jì)策略使HN-PBA在正常組織中不發(fā)射或減弱信號(hào),最大限度地減少了來(lái)自身體的“假陽(yáng)性”信息,,這有利于提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性,。
圖2. HN-PBA(10μM)在pH 6.5下對(duì)不同濃度H2O2的吸收光譜,NIR-I和NIR-II熒光光譜
為了研究在酸性環(huán)境中使用HN-PBA以高特異性和靈敏度檢測(cè)H2O2的可行性,,首先研究了HN-PBA(10μM)的H2O2依賴性吸收和熒光光譜特征,。如圖2a-b所示,HN-PBA本身分別在628/675 nm處顯示出吸收/發(fā)射峰。當(dāng)H2O2水平升高時(shí),,628nm處的吸收逐漸降低,,而825nm處的吸收明顯增加。此外,,HN-PBA暴露于H2O2會(huì)導(dǎo)致675 nm處的NIR-I熒光降低(圖2b),,但在808 nm激發(fā)下檢測(cè)到1060 nm處NIR-II熒光的劑量依賴性增加(圖2c)。這種反應(yīng)歸因于H2O2與硼酸酯的反應(yīng),,該反應(yīng)導(dǎo)致巰基的形成,,從而增強(qiáng)了ICT過(guò)程并導(dǎo)致NIR-II熒光發(fā)射。此外,,1060 nm處的熒光強(qiáng)度與H2O2濃度(50-350μM)呈線性正比,,H2O2的檢測(cè)限計(jì)算為1.2μM(圖2d)。
HN-PBA在腫瘤區(qū)域產(chǎn)生了特定的熒光信號(hào),,表明內(nèi)源性H2O2和酸性腫瘤環(huán)境成功地積累和激活了探針(圖3a,、b)。值得注意的是,,在探針注射(PI)后2小時(shí),,腫瘤輪廓清晰可見(jiàn)。隨著時(shí)間的推移,,腫瘤熒光信號(hào)逐漸增加,,并在24小時(shí)PI達(dá)到最大值(圖3b)。此外,,仍然觀察到相當(dāng)大的熒光強(qiáng)度(約90%的峰值)48h注射后,,背景干擾可忽略不計(jì),表明HN-PBA為腫瘤干預(yù)提供了足夠的時(shí)間,,并在24小時(shí)PI時(shí)達(dá)到27.5±1.5的峰值,。在16-32小時(shí)的PI期間收集到約25的高T/N比,是ICG的7倍多(圖3c),。為了進(jìn)一步證明“雙鎖鍵”探針HN-PBA在區(qū)分腫瘤和增強(qiáng)圖像對(duì)比度方面的優(yōu)勢(shì),,與另一種對(duì)照探針HN-PBC進(jìn)行了比較分析,HN-PBC僅被H2O2激活并鎖定了第二個(gè)“鎖”,,即對(duì)酸性腫瘤基質(zhì)的惰性,。為此,HN-PBA和HN-PBC都被靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi),,并記錄了時(shí)間依賴性的體內(nèi)NIR-II圖像,。如圖3d所示,HN-PBA和HN-PBC負(fù)載的小鼠在腫瘤部位隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)成像信號(hào),,在注射后24小時(shí)達(dá)到最大亮度,,T/NT比值分別為26.1±1.7和6.5±1.9(圖3e),。值得注意的是,與HN-PBC治療組不同,,HN-PBC組隨著時(shí)間的推移在肝臟和腹部顯示非特異性信號(hào)激活,,HN-PBA負(fù)荷組顯示出極低的背景信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度定量顯示,,注射后24小時(shí),,HN-PBA的T/NT比(26.1±1.7)和腫瘤與肝臟比(T/L比(10.7±2.2))比HN-PBC高4.0/4.2倍(圖3f-g)。給藥后48小時(shí)的組織離體分析表明,,HN-PBA治療小鼠的激活信號(hào)主要存在于腫瘤中,,其他器官的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)(圖3h)。相比之下,,注射HN-PBC的小鼠在腫瘤組織和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官(肝臟和脾臟)中都表現(xiàn)出信號(hào)分布(圖3i),。此外,組織光強(qiáng)度定量表明,,HN-PBA在腫瘤和正常器官之間的對(duì)比度高于HN-PBC,,這與全身光學(xué)成像的結(jié)果一致(圖3j)。
圖4. NIR-II圖像引導(dǎo)下手術(shù)切除多發(fā)性微腫瘤
將不同體積的4T1細(xì)胞注射十天后,,在白光成像下可見(jiàn)四個(gè)不同體積的腫瘤(標(biāo)記為a、b,、c和d),。如圖4a所示,注射HN-PBA 2小時(shí)后,,只有體積較大的腫瘤a發(fā)出微弱的熒光信號(hào),,而腫瘤b、c和d顯示的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì),。這一結(jié)果可能因?yàn)槟[瘤體積與腫瘤H2O2濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系,。隨著時(shí)間的推移,熒光信號(hào)在所有腫瘤區(qū)域集中分布,,但在正常組織中幾乎檢測(cè)不到,。腫瘤部位的平均熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖表明,探針的最大積累和激活發(fā)生在PI的16-24小時(shí)(圖4a,,b),。最重要的是,上述多發(fā)性腫瘤的T/NT信號(hào)比在8.2至14.4之間(圖4c),,超過(guò)了T/NT比>5的既定標(biāo)準(zhǔn),。這一發(fā)現(xiàn)表明HN-PBA可以有效地區(qū)分多發(fā)性微腫瘤和鄰近的正常組織。隨后,,在特定的NIR-II成像輔助下,,對(duì)微小腫瘤(標(biāo)記為T1-T4)進(jìn)行了導(dǎo)航,,并通過(guò)病理分析評(píng)估了手術(shù)結(jié)果(圖4d-f)。H&E染色顯示,,切除的腫瘤組織的整個(gè)邊界與正常組織明顯不同,,殘余負(fù)邊緣直徑約為0.25 mm(圖4g)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種重要的血管生成因子,,在腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用,,VEGF的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。與正常組織相比,,腫瘤組織中VEGF的陽(yáng)性信號(hào)更高,,這為切除部位的癌變提供了額外的證據(jù)(圖4g)。
首先,,在第四個(gè)乳腺脂肪墊中使用含有螢火蟲熒光素酶基因(4T1-Luc)的4T1細(xì)胞構(gòu)建原發(fā)性腫瘤模型,,因?yàn)樯锇l(fā)光為評(píng)估腫瘤模型和確定腫瘤位置提供了內(nèi)源性標(biāo)記(圖5a,b),。腫瘤植入后10天,,以100nM的劑量將HN-PBA全身給藥到小鼠體內(nèi)。通過(guò)NIR-II成像和生物發(fā)光監(jiān)測(cè)HN-PBA在腫瘤部位的特異性激活,。如圖5c所示,,靜脈注射探針4小時(shí)后,在小鼠的腫瘤和腹部都檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào),。隨著時(shí)間的推移,,注射后腫瘤部位的明亮和特異性熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),注射后12小時(shí),,原發(fā)性腫瘤的邊界清晰可見(jiàn),,背景干擾微弱,表明內(nèi)源性H2O2/酸性TEM成功激活了探針(圖5c),。注射后24小時(shí),,腫瘤顯示出最大的熒光強(qiáng)度,T/NT比值高達(dá)17.0±2.6,,能夠在圖像引導(dǎo)下切除腫瘤(圖5d),。隨后,使用高特異性NIR-II成像檢查原發(fā)性腫瘤,。值得注意的是,,切除腫瘤的生物發(fā)光信號(hào)與NIR-II成像一致,表明HN-PBA在精確定位原發(fā)腫瘤方面具有很高的可靠性(圖5e,,f),。為了評(píng)估HN-PBA的生物分布,在探針注射后24小時(shí)解剖小鼠,,并對(duì)主要器官和腫瘤進(jìn)行離體NIR-II和生物發(fā)光成像,。由于HN-PBA被過(guò)表達(dá)的H2O2/酸性TEM特異性激活,,腫瘤中的熒光信號(hào)明顯比其他器官中的信號(hào)亮(圖5g,h),。為了驗(yàn)證HN-PBA檢測(cè)轉(zhuǎn)移性病變的潛力,,研究者對(duì)術(shù)后小鼠和同一批原發(fā)性腫瘤小鼠在額外飼養(yǎng)20天后進(jìn)行了體內(nèi)和體外熒光成像研究。在將HN-PBA靜脈注射到術(shù)后和原發(fā)性腫瘤小鼠體內(nèi)后,,捕獲了時(shí)間依賴性熒光圖像(圖5i),。與手術(shù)后小鼠中可忽略的熒光信號(hào)不同,在原代小鼠中觀察到明顯更高的腫瘤信號(hào),,腫瘤邊界清晰(圖5i),。此外,相關(guān)的定量熒光強(qiáng)度表明,,注射后24小時(shí)的最高T/NT比為24.3±3.1,,比原發(fā)性腫瘤植入10天高1.5倍(圖5j)。有趣的是,,在胸腔內(nèi)觀察到微弱的NIR-II熒光信號(hào)(圖5i,,插圖)。研究者推測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移可能發(fā)生在肺部,,產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的H2O2,,并觸發(fā)探針HN-PBA的熒光反應(yīng)。為了驗(yàn)證這一假設(shè),,對(duì)主要器官進(jìn)行了生物發(fā)光成像,、離體圖像和H&E染色測(cè)試。如圖5k所示,,原發(fā)腫瘤區(qū)域和胸腔的生物發(fā)光信號(hào)與體內(nèi)熒光成像一致(圖5i,k),,表明確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)移性病變,。同時(shí),離體NIR-II成像顯示,,肺組織和腫瘤的熒光亮度均高于其他器官(圖5l),。根據(jù)相關(guān)的定量熒光強(qiáng)度分析,肺轉(zhuǎn)移顯示出6.4的高SBR(ROIa/ROId)(圖5m,,n),,而手術(shù)后小鼠肺部的SBR約為1,表明圖像引導(dǎo)手術(shù)切除后沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā),。
靜脈注射4T1-Luci腫瘤細(xì)胞(1X106)10天后,,獲得生物發(fā)光圖像以顯示腫瘤位置并確認(rèn)轉(zhuǎn)移模型的有效建立(圖6a,b),。HN-PBA給藥24小時(shí)后,,解剖小鼠,,離體肺圖像顯示明顯的NIR-II熒光信號(hào)(圖6c),而ICG組觀察到的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)(圖6d),。熒光強(qiáng)度的定量表明,,HN-PBA注射組肺結(jié)節(jié)與正常區(qū)域的信號(hào)比比ICG治療組高2.8倍(SBR計(jì)算為5.8比2.1),驗(yàn)證了HN-PBA在準(zhǔn)確描繪小轉(zhuǎn)移邊界方面的可靠性(圖6e),。隨后,,利用高分辨率NIR-II成像技術(shù)和HN-PBA的高對(duì)比度腫瘤成像能力,進(jìn)行了離體手術(shù)切除(圖6f),。微小的肺轉(zhuǎn)移部位(直徑小至約0.7毫米)很容易被切除(圖6g),。進(jìn)行H&E染色以確認(rèn)轉(zhuǎn)移瘤的精確切除。Ki67染色結(jié)果還顯示,,切除的肺組織中的腫瘤增殖明顯高于正常組織,,進(jìn)一步表明肺中存在轉(zhuǎn)移(圖6h,i),。這些實(shí)驗(yàn)表明,,HN-PBA可以在高特異性NIR-II成像指導(dǎo)下識(shí)別和去除肺轉(zhuǎn)移區(qū)域,突出了研究者提出的“雙鎖鑰匙”探針的潛在臨床應(yīng)用,。
圖7. NIR-II圖像引導(dǎo)癌癥臨床標(biāo)本應(yīng)用
為了進(jìn)一步驗(yàn)證HN-PBA在精確識(shí)別腫瘤組織和劃定腫瘤邊界方面的臨床能力,,從患者中獲得新鮮切除的癌癥組織,并在原位噴灑HN-PBA后使用NIR-II光學(xué)系統(tǒng)成像,。如圖7a,、b所示,HN-PBA給藥10分鐘后可以識(shí)別腫瘤邊緣,,表明探針穿透了腫瘤實(shí)質(zhì),,并被內(nèi)源性H2O2/酸性環(huán)境有效激活。切除的腫瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增加,,并在60分鐘內(nèi)達(dá)到最大值(圖7b-c),。重要的是,腫瘤中區(qū)域a的熒光亮度是區(qū)域c的8.1倍,,使其適用于圖像引導(dǎo)手術(shù)和其他應(yīng)用(圖7c–d),。因此,在高特異性NIR-II熒光成像的指導(dǎo)下,,去除腫瘤邊界(圖7b中的黑色循環(huán))并通過(guò)病理染色進(jìn)行檢查,。H&E染色結(jié)果表明,通過(guò)可見(jiàn)光檢查難以區(qū)分的腫瘤區(qū)域及其邊界可以通過(guò)尾部“雙鍵和鍵”探針HN-PBA進(jìn)行區(qū)分(圖7b-E),。
總之,,成功開發(fā)了一種雙病理參數(shù)協(xié)同激活的NIR-II熒光探針HN-PBA,用于原位和轉(zhuǎn)移性乳腺癌癥的精確腫瘤描繪和圖像引導(dǎo)切除,。通過(guò)利用腫瘤微環(huán)境中固有的弱酸和過(guò)表達(dá)的H2O2水平,,HN-PBA在1060 nm處表現(xiàn)出增強(qiáng)的NIR-II熒光信號(hào),,特別是對(duì)TME內(nèi)H2O2/酸度的共同激活的響應(yīng)。該探針的“雙鎖和鑰匙”設(shè)計(jì)最大限度地減少了非特異性激活和潛在的假陽(yáng)性,,導(dǎo)致T/N比“始終開啟”探針I(yè)CG和單一生物標(biāo)志物(H2O2)激活探針HN-PBC高8.2/4.0倍,。皮下多發(fā)性微腫瘤模型的病理數(shù)據(jù)表明,HN-PBA可以精確地識(shí)別和切除直徑低至約0.25mm的手術(shù)陰性邊緣的腫瘤,。得益于HN-PBA的高分辨率和高特異性NIR-II熒光成像,,原位和轉(zhuǎn)移性乳腺病變與周圍的正常組織可以清楚地區(qū)分,在NIR-II熒光成像的指導(dǎo)下,,直徑約0.7mm的微小肺轉(zhuǎn)移灶可以很容易地切除,。有趣的是,在臨床癌癥標(biāo)本中,,探針有效地描繪了視覺(jué)上難以區(qū)分的病變和邊界,。這種多刺激協(xié)同激活策略將促進(jìn)可靠的熒光診斷劑的開發(fā),用于臨床術(shù)前腫瘤診斷和術(shù)中導(dǎo)航,。
參考文獻(xiàn)
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上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司,被評(píng)為“國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)”,,“上海市專精特新中小企業(yè)”,,榮獲“科技部重大儀器專項(xiàng)立項(xiàng)項(xiàng)目”,上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位,。
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