本文要點(diǎn)：近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像在腫瘤精準(zhǔn)診斷中至關(guān)重要,，具有更高的分辨率和穿透能力。然而,，現(xiàn)有的NIR-II探針要么是“常亮”模式,，要么僅響應(yīng)單一刺激,，導(dǎo)致信噪比低和潛在的假陽(yáng)性問(wèn)題,。本研究提出了一種雙鎖控制的探針HN-PBA,，通過(guò)同時(shí)響應(yīng)H?O?和腫瘤酸性環(huán)境激活熒光信號(hào),。這種雙重響應(yīng)機(jī)制確保了腫瘤部位的明亮熒光信號(hào)，相較于傳統(tǒng)的“常亮”探針和僅響應(yīng)H?O?的探針,，顯著提高了腫瘤與正常組織的對(duì)比度（T/NT）,。該策略能夠精準(zhǔn)識(shí)別并切除原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，T/NT比分別達(dá)到24.3（原發(fā)灶）和6.4（肺轉(zhuǎn)移灶）,。該探針還能有效檢測(cè)直徑≤0.7 mm的肺轉(zhuǎn)移灶,，并在臨床乳腺癌樣本中展示了精準(zhǔn)病灶定位的能力。這種雙重刺激響應(yīng)策略為未來(lái)診斷探針的設(shè)計(jì)提供了新思路,。

動(dòng)物活體成像系統(tǒng)

開發(fā)一種雙鎖控制的NIR-II熒光探針HN-PBA,，用于響應(yīng)酸性腫瘤微環(huán)境（酸性pH/過(guò)氧化氫（H?O?）的雙重刺激。探針有望通過(guò)NIR-II熒光成像同時(shí)提供高特異性的腫瘤識(shí)別和引導(dǎo)手術(shù),，用于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤（方案1）,。探針HN-PBA設(shè)計(jì)有兩個(gè)智能“鎖”，其核心結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)功能模塊,。第一鎖：硼酸酯基團(tuán)作為H?O?響應(yīng)位點(diǎn),，通過(guò)H?O?觸發(fā)的親核反應(yīng)生成硫醇基團(tuán)，增強(qiáng)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）,。第二鎖：羧酸修飾的羅丹明衍生物通過(guò)pH依賴的螺環(huán)化機(jī)制調(diào)節(jié)熒光信號(hào),。HN-PBA探針在自然狀態(tài)下顯示NIR-II熒光信號(hào)“關(guān)”。當(dāng)與兩個(gè)“鑰匙”一起開啟時(shí),，即在酸性介質(zhì)中存在H?O?時(shí),，HN-PBA的硼酸酯可以與H?O?發(fā)生親核相互作用，形成過(guò)渡中間體,，隨后水解生成酚羥基,，接著發(fā)生分子內(nèi)自消除反應(yīng)并生成具有強(qiáng)給電子特性的硫醇基團(tuán)。結(jié)果,，HN-PBA的NIR-II信號(hào)在H?/H?O?的協(xié)同作用下恢復(fù),。光譜研究表明，HN-PBA 探針在pH 6.5的酸性溶液中對(duì)H?O?表現(xiàn)出高靈敏度和特異性響應(yīng),，最大發(fā)射波長(zhǎng)為1,060 nm,。由于實(shí)體瘤環(huán)境中H?O?水平高且pH值弱酸性，HN-PBA可以選擇性地點(diǎn)亮其NIR-II熒光信號(hào),，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的靶向成像和引導(dǎo)干預(yù),。鑒于雙鎖設(shè)計(jì)策略可以有效減少非特異性響應(yīng)和“假陽(yáng)性”信號(hào)干擾，雙刺激激活探針HN-PBA提供了比“常亮”探針I(yè)CG和單生物標(biāo)志物（H?O?）激活探針HN-PBC高8.2/4.0倍的目標(biāo)與噪聲比,。此外,，HN-PBA探針有效引導(dǎo)了多個(gè)微腫瘤的準(zhǔn)確切除,，確保最小殘留陰性切緣低至約0.25 mm。更重要的是,，HN-PBA能夠精確區(qū)分原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺病變與周圍正常組織,。在NIR-II熒光成像的輔助下，直徑約0.7 mm的微小肺轉(zhuǎn)移灶可以被有效切除,。最后,，HN-PBA在臨床腫瘤標(biāo)本的成像中表現(xiàn)出良好的特異性。

接著,，研究了HN-PBA在H+/H2O2共刺激下的光學(xué)響應(yīng),。圖1a中的吸收光譜顯示，在酸性條件下（pH 6.5), HN-PBA在628nm處的吸收下降而在825nm附近出現(xiàn)新的吸收帶,。然而在生理?xiàng)l件下（pH 7.4），在HN-PBA與H2O2的反應(yīng)過(guò)程中,，825 nm處的吸收顯著降低,，并在480 nm處觀察到新的吸收峰。推測(cè)這些新峰可能歸因于兩種形式的反應(yīng)產(chǎn)物,，即HN-PBA-SH（開環(huán),，825 nm）和HN-PBA-SS-SH-SR（螺內(nèi)酰胺，480 nm,，方案1）,。在808 nm激發(fā)下，HN-PBA在1060 nm處的NIR-II熒光信號(hào)在H2O2和酸的存在下表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)（約17.1倍）,。相反,，當(dāng)單獨(dú)存在H2O2（4.1倍）或酸性環(huán)境（pH=6.5，0.8倍）時(shí),，觀察到熒光信號(hào)的變化很?。▓D1b，c）,。此外,，評(píng)估了HN-PBA在H2O2存在下對(duì)pH變化的可逆反應(yīng)（圖1d）。1060nm處的NIR-II信號(hào)在用不同pH介質(zhì)連續(xù)處理后表現(xiàn)出光學(xué)“開啟”到“關(guān)閉”的循環(huán),。值得注意的是,，H+/H2O2雙激活協(xié)同H+可逆反應(yīng)設(shè)計(jì)策略使HN-PBA在正常組織中不發(fā)射或減弱信號(hào)，最大限度地減少了來(lái)自身體的“假陽(yáng)性”信息,，這有利于提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性,。

圖2. HN-PBA（10μM）在pH 6.5下對(duì)不同濃度H2O2的吸收光譜，NIR-I和NIR-II熒光光譜

為了研究在酸性環(huán)境中使用HN-PBA以高特異性和靈敏度檢測(cè)H2O2的可行性,，首先研究了HN-PBA（10μM）的H2O2依賴性吸收和熒光光譜特征,。如圖2a-b所示，HN-PBA本身分別在628/675 nm處顯示出吸收/發(fā)射峰。當(dāng)H2O2水平升高時(shí),，628nm處的吸收逐漸降低,，而825nm處的吸收明顯增加。此外,，HN-PBA暴露于H2O2會(huì)導(dǎo)致675 nm處的NIR-I熒光降低（圖2b）,，但在808 nm激發(fā)下檢測(cè)到1060 nm處NIR-II熒光的劑量依賴性增加（圖2c）。這種反應(yīng)歸因于H2O2與硼酸酯的反應(yīng),，該反應(yīng)導(dǎo)致巰基的形成,，從而增強(qiáng)了ICT過(guò)程并導(dǎo)致NIR-II熒光發(fā)射。此外,，1060 nm處的熒光強(qiáng)度與H2O2濃度（50-350μM）呈線性正比,，H2O2的檢測(cè)限計(jì)算為1.2μM（圖2d）。

HN-PBA在腫瘤區(qū)域產(chǎn)生了特定的熒光信號(hào),，表明內(nèi)源性H2O2和酸性腫瘤環(huán)境成功地積累和激活了探針（圖3a,、b）。值得注意的是,，在探針注射（PI）后2小時(shí),，腫瘤輪廓清晰可見(jiàn)。隨著時(shí)間的推移,，腫瘤熒光信號(hào)逐漸增加,，并在24小時(shí)PI達(dá)到最大值（圖3b）。此外,，仍然觀察到相當(dāng)大的熒光強(qiáng)度（約90%的峰值）48h注射后,，背景干擾可忽略不計(jì)，表明HN-PBA為腫瘤干預(yù)提供了足夠的時(shí)間,，并在24小時(shí)PI時(shí)達(dá)到27.5±1.5的峰值,。在16-32小時(shí)的PI期間收集到約25的高T/N比，是ICG的7倍多（圖3c）,。為了進(jìn)一步證明“雙鎖鍵”探針HN-PBA在區(qū)分腫瘤和增強(qiáng)圖像對(duì)比度方面的優(yōu)勢(shì),，與另一種對(duì)照探針HN-PBC進(jìn)行了比較分析，HN-PBC僅被H2O2激活并鎖定了第二個(gè)“鎖”,，即對(duì)酸性腫瘤基質(zhì)的惰性,。為此，HN-PBA和HN-PBC都被靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi),，并記錄了時(shí)間依賴性的體內(nèi)NIR-II圖像,。如圖3d所示，HN-PBA和HN-PBC負(fù)載的小鼠在腫瘤部位隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)成像信號(hào),，在注射后24小時(shí)達(dá)到最大亮度,，T/NT比值分別為26.1±1.7和6.5±1.9（圖3e）,。值得注意的是，與HN-PBC治療組不同,，HN-PBC組隨著時(shí)間的推移在肝臟和腹部顯示非特異性信號(hào)激活,，HN-PBA負(fù)荷組顯示出極低的背景信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度定量顯示,，注射后24小時(shí),，HN-PBA的T/NT比（26.1±1.7）和腫瘤與肝臟比（T/L比（10.7±2.2））比HN-PBC高4.0/4.2倍（圖3f-g）。給藥后48小時(shí)的組織離體分析表明,，HN-PBA治療小鼠的激活信號(hào)主要存在于腫瘤中,，其他器官的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)（圖3h）。相比之下,，注射HN-PBC的小鼠在腫瘤組織和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官（肝臟和脾臟）中都表現(xiàn)出信號(hào)分布（圖3i）,。此外，組織光強(qiáng)度定量表明,，HN-PBA在腫瘤和正常器官之間的對(duì)比度高于HN-PBC,，這與全身光學(xué)成像的結(jié)果一致（圖3j）。

圖4. NIR-II圖像引導(dǎo)下手術(shù)切除多發(fā)性微腫瘤

將不同體積的4T1細(xì)胞注射十天后,，在白光成像下可見(jiàn)四個(gè)不同體積的腫瘤（標(biāo)記為a、b,、c和d）,。如圖4a所示，注射HN-PBA 2小時(shí)后,，只有體積較大的腫瘤a發(fā)出微弱的熒光信號(hào),，而腫瘤b、c和d顯示的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì),。這一結(jié)果可能因?yàn)槟[瘤體積與腫瘤H2O2濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系,。隨著時(shí)間的推移，熒光信號(hào)在所有腫瘤區(qū)域集中分布,，但在正常組織中幾乎檢測(cè)不到,。腫瘤部位的平均熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖表明，探針的最大積累和激活發(fā)生在PI的16-24小時(shí)（圖4a,，b）,。最重要的是，上述多發(fā)性腫瘤的T/NT信號(hào)比在8.2至14.4之間（圖4c）,，超過(guò)了T/NT比>5的既定標(biāo)準(zhǔn),。這一發(fā)現(xiàn)表明HN-PBA可以有效地區(qū)分多發(fā)性微腫瘤和鄰近的正常組織。隨后,，在特定的NIR-II成像輔助下,，對(duì)微小腫瘤（標(biāo)記為T1-T4）進(jìn)行了導(dǎo)航,，并通過(guò)病理分析評(píng)估了手術(shù)結(jié)果（圖4d-f）。H&E染色顯示,，切除的腫瘤組織的整個(gè)邊界與正常組織明顯不同,，殘余負(fù)邊緣直徑約為0.25 mm（圖4g）。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種重要的血管生成因子,，在腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用,，VEGF的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。與正常組織相比,，腫瘤組織中VEGF的陽(yáng)性信號(hào)更高,，這為切除部位的癌變提供了額外的證據(jù)（圖4g）。

首先,，在第四個(gè)乳腺脂肪墊中使用含有螢火蟲熒光素酶基因（4T1-Luc）的4T1細(xì)胞構(gòu)建原發(fā)性腫瘤模型,，因?yàn)樯锇l(fā)光為評(píng)估腫瘤模型和確定腫瘤位置提供了內(nèi)源性標(biāo)記（圖5a，b）,。腫瘤植入后10天,，以100nM的劑量將HN-PBA全身給藥到小鼠體內(nèi)。通過(guò)NIR-II成像和生物發(fā)光監(jiān)測(cè)HN-PBA在腫瘤部位的特異性激活,。如圖5c所示,，靜脈注射探針4小時(shí)后，在小鼠的腫瘤和腹部都檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào),。隨著時(shí)間的推移,，注射后腫瘤部位的明亮和特異性熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，注射后12小時(shí),，原發(fā)性腫瘤的邊界清晰可見(jiàn),，背景干擾微弱，表明內(nèi)源性H2O2/酸性TEM成功激活了探針（圖5c）,。注射后24小時(shí),，腫瘤顯示出最大的熒光強(qiáng)度，T/NT比值高達(dá)17.0±2.6,，能夠在圖像引導(dǎo)下切除腫瘤（圖5d）,。隨后，使用高特異性NIR-II成像檢查原發(fā)性腫瘤,。值得注意的是,，切除腫瘤的生物發(fā)光信號(hào)與NIR-II成像一致，表明HN-PBA在精確定位原發(fā)腫瘤方面具有很高的可靠性（圖5e,，f）,。為了評(píng)估HN-PBA的生物分布，在探針注射后24小時(shí)解剖小鼠,，并對(duì)主要器官和腫瘤進(jìn)行離體NIR-II和生物發(fā)光成像,。由于HN-PBA被過(guò)表達(dá)的H2O2/酸性TEM特異性激活,，腫瘤中的熒光信號(hào)明顯比其他器官中的信號(hào)亮（圖5g，h）,。為了驗(yàn)證HN-PBA檢測(cè)轉(zhuǎn)移性病變的潛力,，研究者對(duì)術(shù)后小鼠和同一批原發(fā)性腫瘤小鼠在額外飼養(yǎng)20天后進(jìn)行了體內(nèi)和體外熒光成像研究。在將HN-PBA靜脈注射到術(shù)后和原發(fā)性腫瘤小鼠體內(nèi)后,，捕獲了時(shí)間依賴性熒光圖像（圖5i）,。與手術(shù)后小鼠中可忽略的熒光信號(hào)不同，在原代小鼠中觀察到明顯更高的腫瘤信號(hào),，腫瘤邊界清晰（圖5i）,。此外，相關(guān)的定量熒光強(qiáng)度表明,，注射后24小時(shí)的最高T/NT比為24.3±3.1,，比原發(fā)性腫瘤植入10天高1.5倍（圖5j）。有趣的是,，在胸腔內(nèi)觀察到微弱的NIR-II熒光信號(hào)（圖5i,，插圖）。研究者推測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移可能發(fā)生在肺部,，產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的H2O2,，并觸發(fā)探針HN-PBA的熒光反應(yīng)。為了驗(yàn)證這一假設(shè),，對(duì)主要器官進(jìn)行了生物發(fā)光成像,、離體圖像和H&E染色測(cè)試。如圖5k所示,，原發(fā)腫瘤區(qū)域和胸腔的生物發(fā)光信號(hào)與體內(nèi)熒光成像一致（圖5i，k）,，表明確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)移性病變,。同時(shí)，離體NIR-II成像顯示,，肺組織和腫瘤的熒光亮度均高于其他器官（圖5l）,。根據(jù)相關(guān)的定量熒光強(qiáng)度分析，肺轉(zhuǎn)移顯示出6.4的高SBR（ROIa/ROId）（圖5m,，n）,，而手術(shù)后小鼠肺部的SBR約為1，表明圖像引導(dǎo)手術(shù)切除后沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā),。

靜脈注射4T1-Luci腫瘤細(xì)胞（1X106）10天后,，獲得生物發(fā)光圖像以顯示腫瘤位置并確認(rèn)轉(zhuǎn)移模型的有效建立（圖6a，b）,。HN-PBA給藥24小時(shí)后,，解剖小鼠,，離體肺圖像顯示明顯的NIR-II熒光信號(hào)（圖6c），而ICG組觀察到的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)（圖6d）,。熒光強(qiáng)度的定量表明,，HN-PBA注射組肺結(jié)節(jié)與正常區(qū)域的信號(hào)比比ICG治療組高2.8倍（SBR計(jì)算為5.8比2.1），驗(yàn)證了HN-PBA在準(zhǔn)確描繪小轉(zhuǎn)移邊界方面的可靠性（圖6e）,。隨后,，利用高分辨率NIR-II成像技術(shù)和HN-PBA的高對(duì)比度腫瘤成像能力，進(jìn)行了離體手術(shù)切除（圖6f）,。微小的肺轉(zhuǎn)移部位（直徑小至約0.7毫米）很容易被切除（圖6g）,。進(jìn)行H&E染色以確認(rèn)轉(zhuǎn)移瘤的精確切除。Ki67染色結(jié)果還顯示,，切除的肺組織中的腫瘤增殖明顯高于正常組織,，進(jìn)一步表明肺中存在轉(zhuǎn)移（圖6h，i）,。這些實(shí)驗(yàn)表明,，HN-PBA可以在高特異性NIR-II成像指導(dǎo)下識(shí)別和去除肺轉(zhuǎn)移區(qū)域，突出了研究者提出的“雙鎖鑰匙”探針的潛在臨床應(yīng)用,。

圖7. NIR-II圖像引導(dǎo)癌癥臨床標(biāo)本應(yīng)用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HN-PBA在精確識(shí)別腫瘤組織和劃定腫瘤邊界方面的臨床能力,，從患者中獲得新鮮切除的癌癥組織，并在原位噴灑HN-PBA后使用NIR-II光學(xué)系統(tǒng)成像,。如圖7a,、b所示，HN-PBA給藥10分鐘后可以識(shí)別腫瘤邊緣,，表明探針穿透了腫瘤實(shí)質(zhì),，并被內(nèi)源性H2O2/酸性環(huán)境有效激活。切除的腫瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增加,，并在60分鐘內(nèi)達(dá)到最大值（圖7b-c）,。重要的是，腫瘤中區(qū)域a的熒光亮度是區(qū)域c的8.1倍,，使其適用于圖像引導(dǎo)手術(shù)和其他應(yīng)用（圖7c–d）,。因此，在高特異性NIR-II熒光成像的指導(dǎo)下,，去除腫瘤邊界（圖7b中的黑色循環(huán)）并通過(guò)病理染色進(jìn)行檢查,。H&E染色結(jié)果表明，通過(guò)可見(jiàn)光檢查難以區(qū)分的腫瘤區(qū)域及其邊界可以通過(guò)尾部“雙鍵和鍵”探針HN-PBA進(jìn)行區(qū)分（圖7b-E）,。

總之,，成功開發(fā)了一種雙病理參數(shù)協(xié)同激活的NIR-II熒光探針HN-PBA，用于原位和轉(zhuǎn)移性乳腺癌癥的精確腫瘤描繪和圖像引導(dǎo)切除,。通過(guò)利用腫瘤微環(huán)境中固有的弱酸和過(guò)表達(dá)的H2O2水平,，HN-PBA在1060 nm處表現(xiàn)出增強(qiáng)的NIR-II熒光信號(hào),，特別是對(duì)TME內(nèi)H2O2/酸度的共同激活的響應(yīng)。該探針的“雙鎖和鑰匙”設(shè)計(jì)最大限度地減少了非特異性激活和潛在的假陽(yáng)性,，導(dǎo)致T/N比“始終開啟”探針I(yè)CG和單一生物標(biāo)志物（H2O2）激活探針HN-PBC高8.2/4.0倍,。皮下多發(fā)性微腫瘤模型的病理數(shù)據(jù)表明，HN-PBA可以精確地識(shí)別和切除直徑低至約0.25mm的手術(shù)陰性邊緣的腫瘤,。得益于HN-PBA的高分辨率和高特異性NIR-II熒光成像,，原位和轉(zhuǎn)移性乳腺病變與周圍的正常組織可以清楚地區(qū)分，在NIR-II熒光成像的指導(dǎo)下,，直徑約0.7mm的微小肺轉(zhuǎn)移灶可以很容易地切除,。有趣的是，在臨床癌癥標(biāo)本中,，探針有效地描繪了視覺(jué)上難以區(qū)分的病變和邊界,。這種多刺激協(xié)同激活策略將促進(jìn)可靠的熒光診斷劑的開發(fā)，用于臨床術(shù)前腫瘤診斷和術(shù)中導(dǎo)航,。

參考文獻(xiàn)

Dou K, Lu J, Xing Y, et al. Metabolic Acidity/H2O2 Dual‐Cascade‐Activatable Molecular Imaging Platform Toward Metastatic Breast Tumor Malignancy[J]. Angewandte Chemie, 2024: e202419191.

?? ?? ??

動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

?? ?? ??

 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評(píng)為“國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)”,，“上海市專精特新中小企業(yè)”,，榮獲“科技部重大儀器專項(xiàng)立項(xiàng)項(xiàng)目”，上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位,。

恒光智影,，致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的,、一體化的成像解決方案,。

專注動(dòng)物活體成像技術(shù),，成像范圍覆蓋 400-1700 nm,，同時(shí)可整合CT, X-ray，超聲,，光聲,，光熱成像等技術(shù)。

可為腫瘤藥理,、神經(jīng)藥理,、心血管藥理,、大分子藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學(xué)儀器服務(wù),。