IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng),、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)、類器官培養(yǎng),。

人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)

一,、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

1、人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制

（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement,，融化后上下晃動(dòng)混勻,，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲(chǔ)存于-20~-80℃,，避免反復(fù)凍融,；

（2）按1:50的比例將hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403),。

注意：混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周,，不建議使用配制已超過(guò)3周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。

（3） 實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前放置室溫避光平衡,；PBS,，消化液等 37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子,，不要37℃水浴加熱,。

二、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無(wú)菌條件下操作)

hPSC細(xì)胞復(fù)蘇：

1,、實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1.1,、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL基質(zhì)膠(abs9410),，輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底,，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min,。如果暫時(shí)不用,，可用Parafilm封口后2-8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用,。

注意：

①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右,，對(duì)應(yīng)6孔板1孔；

②即用型基質(zhì)膠對(duì)溫度敏感,，即用即拿,，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身,，影響基質(zhì)膠質(zhì)量,。

1.2、先將2~3mL的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用,。

1.3,、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中,，快速搖動(dòng)，使其在1~2min內(nèi)快速解凍,；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快,，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

1.4,、離心：凍存管中的凍存液解凍后,，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后,，1000rpm離心3min,；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻,，吹吸3~5次左右。

1.6,、接種：吹吸均勻后,，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中,，并補(bǔ)全每孔2mL培養(yǎng)體系,。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小,，呈4個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格,，水平十字輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃,，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8,、換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次,。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落

hPSC 細(xì)胞傳代：

2,、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基,，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng),，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2,、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底,，并置于37℃培養(yǎng)箱中2~5min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長(zhǎng)密度,，消化時(shí)間略有不同,，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間2-5min,。消化過(guò)程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙,，即可吸掉消化液終止消化,。

2.3、吹打：吸掉消化液后,，加入2mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基,，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3~5次,，使皿底干細(xì)胞集落脫落,，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔,，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜,，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落,，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落,，需延長(zhǎng)消化時(shí)間,。

2.4、離心：1000rpm離心3min,，棄上清,；

2.5、接種：用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞5-10次,，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠,，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔2mL的培養(yǎng)體系,。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔,，并且吹打次數(shù)不要超過(guò)10次。

2.6,、換液：從傳代的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次,。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落染色圖

hPSC細(xì)胞凍存

3,、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

3.1、清洗：同2.1,；

3.2,、消化：同2.2；

3.3,、吹打：同2.3,；

3.4,、離心：同2.4；

3.5,、重懸：離心后棄上清,，加入2mL ES/iPS細(xì)胞凍存液(abs9412)對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后,，將其加入到凍存管中,；

注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回4℃冰箱,。

3.6,、記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間,、操作者及細(xì)胞批次,。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過(guò)夜,。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí),，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放,。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期凍存,。

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