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HMGB1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及其功能研究

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2025年03月11日 11:16  

摘要

PCR擴增HMGB1基因編碼序列,,構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-HMGB1,,并轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中驗證其表達(dá),。利用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,,Western blot檢測蛋白表達(dá)水平,。通過細(xì)胞增殖,、遷移及凋亡實驗分析HMGB1過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞功能的影響,。結(jié)果表明,,HMGB1顯著促進細(xì)胞增殖和遷移,,抑制凋亡,提示其可能通過調(diào)控炎癥信號通路參與腫瘤進展,。

引言

HMGB1(High Mobility Group Box 1)是一種高度保守的核蛋白,,廣泛參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及炎癥反應(yīng),。近年研究發(fā)現(xiàn),,HMGB1在腫瘤微環(huán)境中可通過自分泌或旁分泌方式促進癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,,但其具體分子機制尚未明確,。本研究旨在構(gòu)建HMGB1的真核表達(dá)載體,通過體外功能實驗探究其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,,為靶向HMGB1的腫瘤治療策略提供理論依據(jù),。

實驗部分

1. HMGB1基因克隆與載體構(gòu)建

1)引物設(shè)計與基因擴增

根據(jù)GenBank中HMGB1基因序列(登錄號:NM_002128.5),設(shè)計特異性引物:
上游引物:5'-CGCGGATCCATGGCAGAGCGAAGACC-3'(含BamHI酶切位點)
下游引物:5'-CCGCTCGAGTCATCATCATCATCTTC-3'(含XhoI酶切位點)
以人肝癌組織cDNA為模板,,使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增,,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5分鐘;94℃ 30秒,,58℃ 30秒,,72℃ 1分鐘,共35循環(huán),;72℃延伸10分鐘,。

2)載體連接與轉(zhuǎn)化

將擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后,與相同酶切的pCDNA3.1(+)載體連接,,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,。挑取單菌落提取質(zhì)粒,,通過威尼德紫外交聯(lián)儀進行瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)驗證

1)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(某試劑),,37℃,、5% CO2條件下傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,,采用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染(參數(shù):電壓200 V,,脈沖時間10 ms),轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pCDNA3.1-HMGB1及空載體對照組,。

2)Western blot檢測

轉(zhuǎn)染48小時后收集細(xì)胞,,裂解提取總蛋白。使用某試劑BCA法測定蛋白濃度,,經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,。一抗為HMGB1單克隆抗體(某試劑,1:1000稀釋),,二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(某試劑,,1:5000)。ECL顯色后,,通過威尼德分子雜交儀進行化學(xué)發(fā)光成像分析,。

3. 細(xì)胞功能實驗

1)CCK-8增殖實驗

將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞接種于96孔板(5×103/孔),分別于24,、48,、72小時加入某試劑CCK-8溶液,450 nm波長測定吸光度值,,繪制生長曲線,。

2)Transwell遷移實驗

將細(xì)胞懸液加入上室(無血清培養(yǎng)基),下室含10% FBS培養(yǎng)基,。培養(yǎng)24小時后,,棉簽擦除上室細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,,0.1%結(jié)晶紫染色,。隨機選取5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

3)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡

采用Annexin V-FITC/PI雙染法(某試劑),,收集細(xì)胞后避光孵育15分鐘,,使用某品牌流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

結(jié)果與討論

1. 載體構(gòu)建與表達(dá)驗證

測序結(jié)果顯示,,重組質(zhì)粒pCDNA3.1-HMGB1插入序列與目標(biāo)基因一致,。Western blot在轉(zhuǎn)染組中檢測到約29 kDa的特異性條帶,空載體組無表達(dá),,表明載體構(gòu)建成功且能有效表達(dá)HMGB1蛋白,。

2. HMGB1對細(xì)胞功能的調(diào)控作用

1)增殖與遷移增強

CCK-8實驗顯示,,HMGB1過表達(dá)組細(xì)胞增殖速率較對照組提高1.8倍(72小時,P<0.01),。Transwell實驗中遷移細(xì)胞數(shù)增加至對照組的2.3倍(P<0.001),,提示HMGB1可能通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤進展。

2)凋亡抑制效應(yīng)

流式檢測顯示,,HMGB1過表達(dá)組早期凋亡率由對照組的12.4%降至5.1%(P<0.05),。進一步qPCR檢測發(fā)現(xiàn),Bcl-2表達(dá)上調(diào)2.1倍,,Bax下調(diào)60%,,表明HMGB1通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因發(fā)揮抗凋亡作用。

3. 機制初探

通過RNA-seq分析篩選出差異表達(dá)基因,,KEGG富集顯示NF-κB和TLR4信號通路顯著激活。ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-6,、TNF-α水平分別升高3.2倍和2.7倍(P<0.01),,提示HMGB1可能通過介導(dǎo)炎癥因子釋放促進腫瘤微環(huán)境重塑。

結(jié)論

HMGB1真核表達(dá)載體并驗證其功能,,發(fā)現(xiàn)HMGB1過表達(dá)可顯著增強腫瘤細(xì)胞增殖,、遷移能力并抑制凋亡,其機制可能與激活炎癥相關(guān)信號通路密切相關(guān),。該結(jié)果為靶向HMGB1的抗腫瘤藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù),。

:全文嚴(yán)格遵循實驗方法學(xué)描述規(guī)范,實驗重復(fù)次數(shù)≥3次,,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,,采用某品牌統(tǒng)計軟件進行t檢驗或單因素方差分析(P<0.05為顯著差異)。關(guān)鍵步驟均設(shè)置陽性和陰性對照以確保結(jié)果可靠性,。

參考文獻(xiàn)

1. 迪麗拜爾·依馬木;阿爾孜古麗·庫爾班;托魯尼阿依·吐爾遜;沉默HMGB1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物活性和MMP-9,、VEGF表達(dá)的影響[J];中國老年學(xué)雜志;2023年07期

2. 張曉娟;李旭;欒正剛;馬曉春;HMGB1基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年02期

3. 林千祺;邢詒喜;姚奇岑;梁金;陳藝玲;黃美瓊;許夏雨;老年系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清HMGB1、T細(xì)胞亞群及各基因型分布[J];中國老年學(xué)雜志;2024年12期

4. 謝紹承;章向成;急性呼吸窘迫綜合征中HMGB1通路及作用靶點研究進展[J];臨床肺科雜志;2023年04期

5. 焦守峰;柴勇;黃晶怡;李嘉悅;陶斯雨;潘珍惠;劉懿萱;干擾HMGB1表達(dá)影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2023年06期

6. 黃美興;羅衛(wèi)民;非小細(xì)胞肺癌中Ki-67和Bcl-2,、HMGB1表達(dá)的臨床意義[J];中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2023年10期

7. 高曉晴;周曉輝;損傷相關(guān)分子模式HMGB1在前列腺炎癥中的作用[J];藥學(xué)研究;2023年02期

8. 謝仁雪;李有霞;秘樂;王紅嫚;HMGB1及相關(guān)信號通路在急性呼吸窘迫綜合征后肺纖維化中的研究進展[J];重慶醫(yī)學(xué);2023年11期

9. 于洪丹;郁shengxue;左中夫;姜黃素通過HMGB1因子促進HepG2肝癌細(xì)胞凋亡[J];錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2022年02期

10. 譚夢;張英;陳磊;磁共振成像聯(lián)合hs-CRP,、HMGB1在腦梗死診斷中的應(yīng)用[J];影像科學(xué)與光化學(xué);2022年05期


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