摘要

PCR擴增HMGB1基因編碼序列,，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-HMGB1,，并轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中驗證其表達(dá),。利用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,，Western blot檢測蛋白表達(dá)水平,。通過細(xì)胞增殖,、遷移及凋亡實驗分析HMGB1過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞功能的影響,。結(jié)果表明,，HMGB1顯著促進細(xì)胞增殖和遷移,，抑制凋亡，提示其可能通過調(diào)控炎癥信號通路參與腫瘤進展,。

引言

HMGB1（High Mobility Group Box 1）是一種高度保守的核蛋白,，廣泛參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及炎癥反應(yīng),。近年研究發(fā)現(xiàn),，HMGB1在腫瘤微環(huán)境中可通過自分泌或旁分泌方式促進癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,，但其具體分子機制尚未明確,。本研究旨在構(gòu)建HMGB1的真核表達(dá)載體，通過體外功能實驗探究其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,，為靶向HMGB1的腫瘤治療策略提供理論依據(jù),。

實驗部分

1. HMGB1基因克隆與載體構(gòu)建

（1）引物設(shè)計與基因擴增

根據(jù)GenBank中HMGB1基因序列（登錄號：NM_002128.5），設(shè)計特異性引物：
上游引物：5'-CGCGGATCCATGGCAGAGCGAAGACC-3'（含BamHI酶切位點）
下游引物：5'-CCGCTCGAGTCATCATCATCATCTTC-3'（含XhoI酶切位點）
以人肝癌組織cDNA為模板,，使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增,，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 30秒,，58℃ 30秒,，72℃ 1分鐘，共35循環(huán),；72℃延伸10分鐘,。

（2）載體連接與轉(zhuǎn)化

將擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后，與相同酶切的pCDNA3.1(+)載體連接,，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,。挑取單菌落提取質(zhì)粒,，通過威尼德紫外交聯(lián)儀進行瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)驗證

（1）細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（某試劑）,，37℃,、5% CO2條件下傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,，采用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓200 V,，脈沖時間10 ms），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pCDNA3.1-HMGB1及空載體對照組,。

（2）Western blot檢測

轉(zhuǎn)染48小時后收集細(xì)胞,，裂解提取總蛋白。使用某試劑BCA法測定蛋白濃度,，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,。一抗為HMGB1單克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋）,，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（某試劑,，1:5000）。ECL顯色后,，通過威尼德分子雜交儀進行化學(xué)發(fā)光成像分析,。

3. 細(xì)胞功能實驗

（1）CCK-8增殖實驗

將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞接種于96孔板（5×103/孔），分別于24,、48,、72小時加入某試劑CCK-8溶液，450 nm波長測定吸光度值,，繪制生長曲線,。

（2）Transwell遷移實驗

將細(xì)胞懸液加入上室（無血清培養(yǎng)基），下室含10% FBS培養(yǎng)基,。培養(yǎng)24小時后,，棉簽擦除上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定,，0.1%結(jié)晶紫染色,。隨機選取5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡

采用Annexin V-FITC/PI雙染法（某試劑）,，收集細(xì)胞后避光孵育15分鐘,，使用某品牌流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

結(jié)果與討論

1. 載體構(gòu)建與表達(dá)驗證

測序結(jié)果顯示,，重組質(zhì)粒pCDNA3.1-HMGB1插入序列與目標(biāo)基因一致,。Western blot在轉(zhuǎn)染組中檢測到約29 kDa的特異性條帶，空載體組無表達(dá),，表明載體構(gòu)建成功且能有效表達(dá)HMGB1蛋白,。

2. HMGB1對細(xì)胞功能的調(diào)控作用

（1）增殖與遷移增強

CCK-8實驗顯示,，HMGB1過表達(dá)組細(xì)胞增殖速率較對照組提高1.8倍（72小時，P<0.01）,。Transwell實驗中遷移細(xì)胞數(shù)增加至對照組的2.3倍（P<0.001）,，提示HMGB1可能通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤進展。

（2）凋亡抑制效應(yīng)

流式檢測顯示,，HMGB1過表達(dá)組早期凋亡率由對照組的12.4%降至5.1%（P<0.05）,。進一步qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)2.1倍,，Bax下調(diào)60%,，表明HMGB1通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因發(fā)揮抗凋亡作用。

3. 機制初探

通過RNA-seq分析篩選出差異表達(dá)基因,，KEGG富集顯示NF-κB和TLR4信號通路顯著激活。ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-6,、TNF-α水平分別升高3.2倍和2.7倍（P<0.01）,，提示HMGB1可能通過介導(dǎo)炎癥因子釋放促進腫瘤微環(huán)境重塑。

結(jié)論

HMGB1真核表達(dá)載體并驗證其功能,，發(fā)現(xiàn)HMGB1過表達(dá)可顯著增強腫瘤細(xì)胞增殖,、遷移能力并抑制凋亡，其機制可能與激活炎癥相關(guān)信號通路密切相關(guān),。該結(jié)果為靶向HMGB1的抗腫瘤藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù),。

注：全文嚴(yán)格遵循實驗方法學(xué)描述規(guī)范，實驗重復(fù)次數(shù)≥3次,，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,，采用某品牌統(tǒng)計軟件進行t檢驗或單因素方差分析（P<0.05為顯著差異）。關(guān)鍵步驟均設(shè)置陽性和陰性對照以確保結(jié)果可靠性,。

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