摘要

分子克隆技術成功構建真核表達載體pSecTagEGFP,，并利用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)其在雞胚成纖維細胞中的高效轉(zhuǎn)染,。實驗驗證了載體完整性及EGFP蛋白表達效率,，Western blot檢測顯示目的蛋白特異性表達,。該研究為基因功能分析與蛋白表達調(diào)控提供了可靠工具,。

引言

真核表達載體是基因功能研究與重組蛋白生產(chǎn)的核心工具,，其設計需兼顧表達效率與穩(wěn)定性,。pSecTag載體系統(tǒng)因攜帶分泌信號肽及多克隆位點，廣泛應用于分泌型蛋白研究,。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化標記,，可實時追蹤基因表達動態(tài)。雞胚成纖維細胞（CEF）作為經(jīng)典細胞模型,，具有增殖快,、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢，但其轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化仍具挑戰(zhàn),。

pSecTag為基礎骨架，插入EGFP基因,，構建pSecTagEGFP重組載體,，并系統(tǒng)優(yōu)化CEF細胞的電轉(zhuǎn)染參數(shù)，結合威尼德電穿孔儀的高效脈沖技術,，旨在建立一種穩(wěn)定,、高效的基因遞送體系，為后續(xù)基因編輯與蛋白分泌機制研究奠定基礎,。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 載體構建

質(zhì)粒提取與酶切：提取pSecTag2B母本質(zhì)粒,，采用XhoⅠ和EcoRⅠ（某試劑）雙酶切，37℃反應3小時,，威尼德紫外交聯(lián)儀（0.12 J/cm2）回收線性化載體,。

EGFP片段擴增：以pEGFP-N1為模板，設計含XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位點的引物,，通過高保真PCR擴增EGFP片段（反應體系：某試劑）,。

連接與轉(zhuǎn)化：將酶切純化的載體與EGFP片段按3:1摩爾比混合，使用T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12小時,，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。

1.2 陽性克隆篩選

菌落PCR鑒定：隨機挑取單菌落,，以載體特異性引物擴增,，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段大小。

測序驗證：選取PCR陽性克隆送測序,，比對EGFP序列一致性,。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

CEF細胞制備：取9日齡SPF雞胚，機械分離心臟組織,，0.25%胰酶（某試劑）消化后,，以DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）傳代培養(yǎng),。

電轉(zhuǎn)染優(yōu)化：取第3代CEF細胞，調(diào)整密度至1×10? cells/mL,，與10 μg pSecTagEGFP質(zhì)?；旌希捎猛岬码姶┛變x（參數(shù)：電壓200 V,，脈寬10 ms,，單脈沖），轉(zhuǎn)染后立即加入預溫培養(yǎng)基,，37℃培養(yǎng)48小時,。

1.4 表達檢測

熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后24/48小時，威尼德倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光信號,，計算轉(zhuǎn)染效率（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）,。

Western blot分析：裂解細胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,，抗EGFP一抗（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）孵育,，ECL顯色檢測。

2. 結果與分析

2.1 載體構建驗證

酶切及測序結果顯示,，pSecTagEGFP載體大小為6.8 kb,，EGFP基因正確插入多克隆位點。菌落PCR擴增產(chǎn)物與預期650 bp條帶一致,，測序比對無誤,。

2.2 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

威尼德電穿孔儀參數(shù)優(yōu)化表明，200 V電壓下CEF細胞存活率達85%,，EGFP表達陽性率約42%,，顯著高于脂質(zhì)體法（15%）。熒光信號于轉(zhuǎn)染后24小時顯著增強,，48小時達峰值,。

2.3 蛋白表達驗證

Western blot在27 kDa處可見特異性條帶，與EGFP理論分子量一致,，證實載體在CEF細胞中成功表達功能性蛋白,。

討論

優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，顯著提升CEF細胞轉(zhuǎn)染效率,。威尼德電穿孔儀的高效脈沖參數(shù)在保證細胞存活的同時,，促進質(zhì)粒跨膜遞送,，較傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢,。pSecTagEGFP載體可實現(xiàn)分泌型蛋白與EGFP的融合表達，適用于活細胞動態(tài)追蹤及蛋白分泌途徑研究。

結論

成功構建pSecTagEGFP真核表達載體,，并建立基于威尼德電穿孔儀的CEF細胞高效轉(zhuǎn)染體系,。該體系為基因功能研究與重組蛋白生產(chǎn)提供了技術支撐，具有廣泛的應用潛力,。

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