操作方法：以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為例
（初次使用 PEI 進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)先做預(yù)試,，優(yōu)化出適合自己實(shí)驗(yàn)的最 佳 PEI 和 DNA 的比例,。）

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：

1. 轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶),。按照每孔2x106的細(xì)胞量接種 293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養(yǎng)基和1ml的細(xì)胞懸液)置于 37°C,，5%C02,，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,。

2. 24h后,，移除之前培養(yǎng)基,，每孔加入2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS,。
注意:確保 293T 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好傳代不超過(guò) 15 代。

轉(zhuǎn)染流程：
1. 第一天: 顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度,，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%到 80%的匯合度時(shí),，開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
2. 對(duì)于每孔細(xì)胞,，用 100μL無(wú)血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）,。

3. 對(duì)于每孔細(xì)胞，用 100μL無(wú)血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEM I培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的適量24765-1,。DNA:PEI的比例要依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)摸索最適比例,。
4. 將稀釋的 24765-1轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積 200μL)輕輕混勻,，室溫孵育 30 分鐘。

4. 小心地將 PEI-DNA 復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中,，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻,。注意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細(xì)胞的頂部以免破壞細(xì)胞的粘附性,。
6. 將培養(yǎng)板放入 37°C,，5%C02,培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

觀察結(jié)果：
第二天,，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,，通常超過(guò) 80%的 293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的 24h可以觀察到綠色熒光。

注意：
√ 建議進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)對(duì) PEI 和 DNA 的比例進(jìn)行優(yōu)化,，以達(dá)到最適比例,，通常 篩選范圍在 1:1 到 5:1 之間。

√ 通常情況下,，分別準(zhǔn)備 PEI 和 DNA 轉(zhuǎn)染溶液時(shí)其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞培養(yǎng)液 體積總量的 1/10-1/20,，如細(xì)胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋 PEI 及 DNA 的體積為 150ul ,。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質(zhì)量/細(xì)胞培養(yǎng)總體積）,。

√ 不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，如較大片段插入質(zhì)?？赡苻D(zhuǎn)染效率低,，可根據(jù) 實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭康?。

√ HEK293 GnTI 細(xì)胞重懸浮可用槍頭或移液管反復(fù)吹打，但 CHO-S 細(xì)胞的粘附性比較強(qiáng),，重懸浮時(shí)需要借助細(xì)胞刮刀,。

√ 一般建議用膠原酶消化細(xì)胞，如果表達(dá)的是膜蛋白,，胰酶消化細(xì)胞可能會(huì)降低蛋白表達(dá),， 建議用膠原酶消化細(xì)胞。
√ 對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系,，可用明膠或鼠尾膠鋪板,，增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

√ 一旦確定了細(xì)胞類型,、培養(yǎng)基和 PEI 與 DNA 的最佳比例,，就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時(shí)內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率，以優(yōu)化最大表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)。

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