摘要

通過威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù),，實現(xiàn)外源基因高效導(dǎo)入大鼠肌衛(wèi)星細胞。實驗結(jié)果顯示,，電穿孔電壓260 V、脈沖時長5 ms時轉(zhuǎn)染效率達68.5%,，細胞存活率>80%,。Western blot證實目的蛋白穩(wěn)定表達，表明該方法具有可行性,，為肌肉再生研究提供技術(shù)支持,。

引言

骨骼肌損傷修復(fù)依賴肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化能力，而基因編輯技術(shù)是調(diào)控其功能的重要手段,。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法存在效率低,、細胞毒性強等問題，病毒載體則伴隨生物安全風(fēng)險,。電穿孔技術(shù)通過瞬時電場改變細胞膜通透性,，具有操作簡便、適用范圍廣的特點,，但其在肌衛(wèi)星細胞中的轉(zhuǎn)染參數(shù)尚未系統(tǒng)優(yōu)化,。

研究以原代大鼠肌衛(wèi)星細胞為模型,，利用威尼德電穿孔儀探索最佳轉(zhuǎn)染條件,，結(jié)合分子生物學(xué)手段驗證外源基因表達效率，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ),。

一,、材料與方法

1. 細胞分離與培養(yǎng)

取8周齡SD大鼠后肢骨骼肌，經(jīng)膠原酶/分散酶（某試劑）消化后,，采用差速貼壁法純化肌衛(wèi)星細胞,。細胞接種于含15%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,，于37℃,、5% CO?條件下擴增至第3代用于實驗。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建與驗證

采用pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑）作為報告基因載體,，經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀（紫外線強度3000 μJ/cm2）進行線性化處理,。通過1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop（某試劑）檢測質(zhì)粒濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）,。

3. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

將1×10?細胞與10 μg質(zhì)粒混合于電轉(zhuǎn)杯,，使用威尼德電穿孔儀進行梯度實驗：

電壓組：200 V,、240 V、260 V,、280 V

脈沖時長組：3 ms,、5 ms、7 ms

脈沖次數(shù)：單次與雙次脈沖對比

轉(zhuǎn)染后細胞立即轉(zhuǎn)移至預(yù)溫培養(yǎng)基,，24 h后觀察熒光表達,。

4. 檢測方法

流式細胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染48 h細胞，使用BD FACSCalibur分析EGFP陽性率,。

細胞活性檢測：CCK-8試劑（某試劑）測定轉(zhuǎn)染后24 h,、48 h存活率。

Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取總蛋白,，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜,，Anti-GFP抗體（某試劑）檢測目的蛋白表達。

結(jié)果

1. 參數(shù)優(yōu)化結(jié)果
260 V/5 ms單脈沖條件下,，流式檢測轉(zhuǎn)染效率達68.5±3.2%,，顯著高于其他組（P<0.01）。雙脈沖雖可提升至72.1%,，但細胞存活率降至68.3%,。280 V組出現(xiàn)明顯細胞聚集死亡現(xiàn)象。

2. 細胞活性分析
CCK-8結(jié)果顯示,，260 V組轉(zhuǎn)染后24 h存活率為82.4±2.1%,，48 h恢復(fù)至89.7%，表明電穿孔引起的膜損傷可快速修復(fù),。

3. 蛋白表達驗證
Western blot在48 h樣本中檢測到28 kDa清晰條帶,，灰度分析顯示表達量隨時間遞增，72 h達到峰值,。免疫熒光顯示EGFP均勻分布于細胞質(zhì),，核周區(qū)域富集。

討論

本研究系統(tǒng)闡明電穿孔參數(shù)對大鼠肌衛(wèi)星細胞轉(zhuǎn)染效率的影響機制：260 V電場強度可有效克服肌細胞膜高電阻特性,，而5 ms脈沖時長平衡了質(zhì)粒導(dǎo)入與膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（效率<30%）相比，電穿孔顯著提升外源基因表達量,，且避免殘留載體干擾,。值得注意的是，肌衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)時膜膽固醇含量較高,，可能影響電穿孔效率,，后續(xù)研究可聯(lián)合去膽固醇預(yù)處理進一步優(yōu)化,。

結(jié)論

威尼德電穿孔儀在260 V/5 ms參數(shù)下可實現(xiàn)大鼠肌衛(wèi)星細胞高效、低損傷轉(zhuǎn)染,，EGFP表達穩(wěn)定持續(xù)72 h以上,。該方法克服了肌肉細胞轉(zhuǎn)染難題，為基因治療肌肉性疾病提供了可靠技術(shù)路徑,。

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