來(lái)源：醫(yī)研三人行

各位熱愛科研的小伙伴們,，你是科研小白還是準(zhǔn)備上研一的師弟師妹們，戴師兄給你帶來(lái)一系列體內(nèi)腫瘤動(dòng)物模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)專題：CT26結(jié)直腸癌模型皮下及原位小鼠構(gòu)建,。

PS:CT26細(xì)胞是一種源自小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系,，廣泛用于腫瘤學(xué)研究，尤其是在研究腫瘤免疫學(xué)和抗癌藥物測(cè)試中,。

另外：同源CT26結(jié)直腸癌小鼠代表一種特征明確且廣泛使用的癌癥惡病質(zhì)模型 ,。腫瘤的生長(zhǎng)導(dǎo)致身體和肌肉重量減輕，主要是通過增強(qiáng)脂肪和蛋白質(zhì)分解代謝,。隨著腫瘤生長(zhǎng),，還觀察到肝腫大和脾腫大，以及急性期反應(yīng)的激活和促炎細(xì)胞因子水平的升高,。

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寫在前面

皮下和原位腫瘤細(xì)胞動(dòng)物模型的相同點(diǎn)

1）研究目的：兩種模型都用于研究腫瘤的生長(zhǎng),、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制,，以及評(píng)估抗腫瘤藥物和治療方法的效果,。

2）成瘤性：在兩種模型中，腫瘤細(xì)胞都能在宿主動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)形成腫瘤,，并被用于評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)速率,、體積以及對(duì)治療的反應(yīng)。

皮下和原位腫瘤細(xì)胞動(dòng)物模型的不同點(diǎn)

1）腫瘤植入位置不同：皮下腫瘤模型：將腫瘤細(xì)胞注射到動(dòng)物的皮下組織中,，通常選擇在背部或側(cè)腹部,。原位腫瘤模型：將腫瘤細(xì)胞注射到原發(fā)腫瘤發(fā)生的器官或組織中（例如將結(jié)腸癌細(xì)胞注射到小鼠的結(jié)腸中）。

2）腫瘤微環(huán)境：皮下腫瘤模型：由于腫瘤細(xì)胞被植入到皮下組織中,，其微環(huán)境與原發(fā)腫瘤的位置不同,，因此可能不wan全反映出原發(fā)腫瘤的行為。原位腫瘤模型：腫瘤細(xì)胞被植入到其原發(fā)組織或器官中,，因此更好地模擬了腫瘤的生理微環(huán)境,，包括血供、基質(zhì)細(xì)胞,、免疫細(xì)胞和局部信號(hào)分子,。

3）其他：臨床相關(guān)性、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,、操作難度的不同,。

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CT26結(jié)直腸癌模型皮下小鼠構(gòu)建

• 實(shí)驗(yàn)材料

1）CT26細(xì)胞：常規(guī)復(fù)蘇后擴(kuò)增培養(yǎng),，至少傳代2次后收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

2）BALB/c小鼠：雄性：16~22g/6~8周齡（shou選）,；雌性：14~18g/6~8周齡,。（注：適應(yīng)性飼養(yǎng)1周）

• 實(shí)驗(yàn)方法

1）C26 細(xì)胞的生長(zhǎng)和制備（注：為了實(shí)現(xiàn)更好的實(shí)驗(yàn)間重現(xiàn)性，盡可能收集傳代次數(shù)低的細(xì)胞）

2）小鼠準(zhǔn)備及麻醉：通過吸入異氟醚（氧氣 3%）麻醉小鼠,。在進(jìn)行腫瘤接種所需的時(shí)間內(nèi)僅將動(dòng)物保持在麻醉狀態(tài),。確保鼠放在加熱墊上，以防止身體熱量流失,。在開始腫瘤注射之前,，通過輕輕捏后腳趾來(lái)確認(rèn)適當(dāng)?shù)穆樽怼?/p>

3）使用無(wú)菌1 ml胰島素注射器和26號(hào)針頭，將0.2mL含有腫瘤細(xì)胞（500萬(wàn)/只）的溶液快速注射到小鼠右側(cè)腋下的脂肪墊皮下,。（注：對(duì)照動(dòng)物將在相同位置接受0.2mL無(wú)菌鹽水溶液,。）（注：細(xì)胞濃度通常為1×10^6~1×10^7個(gè)細(xì)胞/ml）

4）將動(dòng)物放回籠子里。每 15 分鐘至少直接觀察一次鼠,，直到它可以對(duì)溫和的操作做出反應(yīng)并恢復(fù)翻正反射,，最后再放回籠子內(nèi)集中飼養(yǎng)，確保提供足夠的水和食物,。

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CT26結(jié)直腸癌模型原位小鼠構(gòu)建

• 實(shí)驗(yàn)材料

1）CT26細(xì)胞或者CT26瘤塊：細(xì)胞培養(yǎng)同上；瘤塊組織（直接用皮下成瘤的瘤塊進(jìn)行原位接種（1mm3左右的直徑大?。?/p>

2）基質(zhì)膠：Corning Matrigel是最chang用的基質(zhì)膠（基質(zhì)膠：細(xì)胞體積=1:1）

3）BALB/c小鼠：雄性：16~22g/6~8周齡（shou選）,；雌性：14~18g/6~8周齡。（注：適應(yīng)性飼養(yǎng)1周）

4）手術(shù)工具：手術(shù)刀,、剪刀,、鑷子、止血鉗,、縫合針線等

• 實(shí)驗(yàn)方法

1）小鼠準(zhǔn)備及麻醉：通過吸入異氟醚（氧氣 3%）麻醉小鼠,。在進(jìn)行腫瘤接種所需的時(shí)間內(nèi)僅將動(dòng)物保持在麻醉狀態(tài)。確保鼠放在加熱墊上,，以防止身體熱量流失,。在開始腫瘤注射之前，通過輕輕捏后腳趾來(lái)確認(rèn)適當(dāng)?shù)穆樽怼?/p>

2）準(zhǔn)備手術(shù)區(qū)：剪除小鼠腹部毛發(fā),，用碘伏和75%乙醇消毒手術(shù)區(qū),。

3）腹腔切口：在小鼠下腹部正中線沿腹白線做一小切口（約1~2 cm），切開皮膚和腹膜,，暴露腹腔內(nèi)容物,。（注：開口不要開太大，避免感染）

4）暴露結(jié)腸：小心分離并輕輕牽引結(jié)腸,，確保不損傷周圍組織,。

5）細(xì)胞注射：使用注射器（常用26或27號(hào)針頭）吸取預(yù)先準(zhǔn)備好的CT26細(xì)胞懸液,。將注射器的針頭插入結(jié)腸壁，緩慢注射約50-100 μl的CT26細(xì)胞懸液,。注射位置一般選擇結(jié)腸的中段或直腸靠近肛men處,，以模擬人類直腸癌的發(fā)生位置。（確保細(xì)胞懸液均勻分布,，并避免針頭穿透腸壁,。）

或者瘤塊接種：用套管針將瘤塊注射結(jié)腸的中段或直腸靠近肛men處，以模擬人類直腸癌的發(fā)生位置,。

6）縫合傷口：輕輕將結(jié)腸放回腹腔內(nèi),，確保沒有捻轉(zhuǎn)或扭曲。用縫合針線將腹膜和皮膚分層縫合,。

7）將動(dòng)物放回籠子里,。每 15 分鐘至少直接觀察一次鼠，直到它可以對(duì)溫和的操作做出反應(yīng)并恢復(fù)翻正反射,，最后再放回籠子內(nèi)集中飼養(yǎng),。確保提供足夠的水和食物，并注意觀察術(shù)后可能出現(xiàn)的感染或不適癥狀,。

8）腫瘤生長(zhǎng)檢測(cè)：每隔2-3天觀察小鼠的體重,、活動(dòng)狀態(tài)和糞便情況。根據(jù)需要在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為14天后）進(jìn)行小鼠的安le死,，并解剖檢測(cè)原位腫瘤的生長(zhǎng)情況和轉(zhuǎn)移情況,。

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實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)及注意事項(xiàng)

1. 皮下腫瘤的觀察：在di一階段，腫瘤只能通過觸診來(lái)定位,，并且表現(xiàn)為皮膚的小突起,。在第二階段，觀察到腫瘤為皮下腫塊,。極少數(shù)情況下,，腫瘤會(huì)潰爛，導(dǎo)致開放性傷口,；在這種情況下,，小鼠被排除在實(shí)驗(yàn)組之外并被人道安le死。

2. 如何提高腫瘤成瘤的重復(fù)率：動(dòng)物品系,、性別,、腫瘤細(xì)胞的來(lái)源、傳代次數(shù),、注射細(xì)胞的數(shù)量以及注射位置,，以上幾個(gè)方面重點(diǎn)關(guān)注。