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顯微課堂 | 不可能的任務(wù)：可調(diào)顏色用于非掃描檢測
徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測器是 SP8 DIVE 深度體內(nèi)探測器的關(guān)鍵組件,，提供具有非掃描檢測的光譜可調(diào)圖像記錄,，是多參數(shù)多光子顯微鏡的創(chuàng)新解決方案,。
為什么要使用多參數(shù)顯微鏡？
生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熒光顯微鏡通常關(guān)注一系列不同顏色發(fā)射的相關(guān)性,。不同的顏色代表特定染色的結(jié)構(gòu)或代謝參數(shù),。生物學(xué)是研究生物體的科學(xué),，而生物體即使在微觀尺度上也在運(yùn)動,。這一事實(shí)不僅適用于快速移動的原生動物,，也適用于被認(rèn)為是靜態(tài)的個(gè)體，如植物,。細(xì)胞區(qū)室,、蛋白質(zhì)和代謝分子通常用不同顏色的熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。多光子顯微鏡增加了其他選項(xiàng),，如二次和三次諧波生成,。這些顏色通道最好是同時(shí)記錄，即并行記錄，以保持它們在高度動態(tài)變化的環(huán)境中的相關(guān)性,。通過這種方式,，同時(shí)記錄保留了被研究生物參數(shù)之間的時(shí)間和空間相互關(guān)系，并且提高了時(shí)間分辨率,。這需要多個(gè)光傳感器用于不同的顏色通道,，這些傳感器并行工作,，并同時(shí)提供相關(guān)光譜的光的分?jǐn)?shù),。
替代方案是順序記錄，其中為不同的光譜分?jǐn)?shù)提供一個(gè)單一傳感器,，依次記錄每個(gè)分?jǐn)?shù)的圖像并隨后疊加,。使用順序方法，不僅可能會喪失空間和時(shí)間的相關(guān)性,，而且時(shí)間分辨率也降低,，降低的幅度至少等于記錄參數(shù)的數(shù)量。因此,，整個(gè)數(shù)據(jù)采集所需的時(shí)間要長得多：按相同的比例,。
同時(shí)記錄光譜發(fā)射分?jǐn)?shù)的經(jīng)典解決方案是使用二色光束分割鏡和阻擋濾光片的排列。這種設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)是,，對于更改的染料組合,，系統(tǒng)必須提供適當(dāng)?shù)臑V光配置，使其成為一種成本高,、速度慢且不靈活的解決方案,。
可調(diào)多波段檢測
對于單通道系統(tǒng)，這種不靈活性通過使用光譜設(shè)備——光譜儀被消除了,。1997 年,，徠卡激光技術(shù)公司推出了第一款具有自由可調(diào)檢測通道的多通道光譜設(shè)備，允許共聚焦顯微鏡同時(shí)記錄不同顏色的圖像：SP 探測器,。[1]
該 SP 探測器解決方案用于共聚焦顯微鏡,，采用一個(gè)棱鏡將檢測光分成其光譜成分，并通過一組級聯(lián)光譜儀狹縫將可調(diào)帶傳遞到傳感器,。電動屏障由反射鏡制成,，因此可以將互補(bǔ)部分進(jìn)一步引導(dǎo)到傳感器上。通過這種方式,，完整的光譜可以被切割成多個(gè)部分,，每個(gè)部分可以進(jìn)行微調(diào)，以實(shí)現(xiàn)通道的最佳分離,，而無需進(jìn)行復(fù)雜的計(jì)算,。這個(gè)概念依賴于共聚焦顯微鏡中發(fā)射光束是靜止的這一事實(shí)。掃描運(yùn)動通過掃描鏡進(jìn)行補(bǔ)償，發(fā)射的光以相反的方向經(jīng)過這些鏡子,。然后,，靜止的光束通過檢測針孔，生成光學(xué)切片,。
然而,，在多光子顯微鏡中，光學(xué)切片是通過光子的非線性相互作用產(chǎn)生的,，這種相互作用在焦平面上具有足夠的密度,。因此，不需要針孔,，發(fā)射的光可以在通過掃描設(shè)備之前被檢測到,，即非掃描檢測。這種方法對于成像深處的渾濁物體（如許多生物樣本）尤其重要,，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出顯著的散射,，導(dǎo)致光子損失。使用非掃描探測器,，收集效率大大提高,，圖像更加清晰，研究人員可以更深入地觀察標(biāo)本,。然而,，這一概念沒有靜態(tài)光束，這導(dǎo)致光譜在棱鏡和光譜儀狹縫上晃動,，從而導(dǎo)致位置依賴的光譜響應(yīng),。
漸變選項(xiàng)
到目前為止，非掃描探測器中各種發(fā)射通道的分離是通過二色鏡和具有固定光譜規(guī)格的阻擋濾光片來實(shí)現(xiàn)的,。當(dāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置發(fā)生變化時(shí),，濾光片也需要更換。沒有辦法通過不斷改變?yōu)V光片參數(shù)來優(yōu)化性能,。一個(gè)明顯的解決方案是用梯度元件替換光譜固定元件,。與普通的二色分光器和濾光片不同，梯度元件在一個(gè)空間維度上具有光譜變化,。簡單的顏色漸變?yōu)V光片通常用于效果攝影,，但也有高性能的介電濾光片和分光器。當(dāng)梯度濾光片在光束周圍移動時(shí),，出射光束的光譜特性可以不斷調(diào)節(jié),。因此，梯度濾光片被隨意稱為“可變?yōu)V光片”,。圖 1 展示了這一二色光束分割的原理,，短通或長通濾光也類似適用。
圖 1： 用作可調(diào)（可變）二色分光器的梯度二色器的性能。左：發(fā)射（E）通過可變二色分光器 VDS 分成兩個(gè)顏色帶,。反射（R）到透射（T）的切換發(fā)生在較長波長（λ）處,。右：當(dāng)移動 VDS 的位置時(shí)，R 到 T 的切換發(fā)生在較短波長處,。
我們只需要通過使用光譜的透射和反射部分制作這樣的漸變二色鏡的級聯(lián),，就可以同時(shí)記錄多個(gè)通道以進(jìn)行進(jìn)一步的分段。為了微調(diào)收集到的發(fā)射光,，我們可以在探測器前放置一組可變的短通和長通濾光片,。
圖 2： 微調(diào)發(fā)射（E），例如通過可變帶通濾波器（VBF）減少串?dāng)_,。左側(cè)：調(diào)諧到紅色波段,。右側(cè)：調(diào)諧到藍(lán)色波段,。帶邊緣是可單獨(dú)調(diào)諧的,，因此中心頻率和帶寬也是可調(diào)的。
到目前為止,，一切都很好,。
但有新的挑戰(zhàn)
盡管我們可以通過梯度濾光片構(gòu)建一個(gè)具有可調(diào)光譜檢測通道的非掃描探測器，但掃描顯微鏡需要一個(gè)巧妙的設(shè)計(jì)來進(jìn)行設(shè)置,。掃描光束的角度和位置變化以及梯度介電光學(xué)濾光片的特性導(dǎo)致了這種設(shè)計(jì)的需求,。接下來的兩個(gè)部分將討論這兩個(gè)方面。
掃描顯微鏡
掃描顯微鏡的設(shè)計(jì)是將光點(diǎn)在焦平面上沿兩個(gè)方向（x 和 y）移動,。因此,，光束在焦平面（圖 3 中的 F）或任何與場共軛的平面中的位置是不斷變化的，例如,，中間圖像平面,。
圖 3： 掃描顯微鏡中的光束特性由每束光線的主光線（主光線）a、b 和 c 顯示,，這些光線穿過顯微鏡,。光線 a、b 和 c 照亮了場平面 F 中的不同位置,。它們通過光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為不同的角度,，但在瞳孔平面 P 中位置固定。在 F 和 P 之間的平面 G 中,，位置和角度都在變化,。
在瞳孔平面（參見圖 3 中的 P），它與顯微鏡物鏡的后焦平面重合,，位置是固定的,，但角度隨著掃描過程不斷變化。這個(gè)關(guān)系被用來方便地掃描樣本，而不需要移動標(biāo)本或光源,。掃描鏡被放置在與后焦平面共軛的平面中,。當(dāng)掃描時(shí)，鏡子改變光束角度,，這會導(dǎo)致焦平面中的位置變化,。
在任何像 G 這樣的平面中，位于 F 和 P 之間,，角度和位置都隨著掃描而變化,。
濾光器特性
不同設(shè)計(jì)的濾光器表現(xiàn)不同，具體取決于它們的位置和角度（見圖 4）,。
1
色素濾光片：
對于傳統(tǒng)的顏色濾光片,，通常是含有顏色顏料的玻璃片，光束通過濾光玻璃的位置對光譜性能沒有影響,。當(dāng)以非垂直方式照射這樣的濾光片時(shí),，光在均勻材料中通過的距離變長。因此,，透過率降低,。
圖 4： 不同設(shè)計(jì)概念的光學(xué)顏色濾光器的行為，取決于照明位置和角度,。有關(guān)更多細(xì)節(jié),，請參見正文。
2
干涉濾光片：
由一個(gè)空的玻璃基板組成,，表面涂覆有特定順序的介電材料層,，因此也被稱為介電濾光片。這些層會導(dǎo)致通過的光線之間發(fā)生干涉,。層的厚度和材料成分的組合使得過濾作用得以實(shí)現(xiàn),，允許光譜中所需的部分通過濾光片，而相應(yīng)的部分則被反射,。未在垂直照明下操作的干涉濾光片可以收集傳輸和反射的部分,。在這種情況下，濾光片被稱為二色鏡,。對于均勻涂覆的濾光片和二色鏡,，照明位置對傳輸光沒有影響。然而,，入射角的變化會導(dǎo)致二色鏡的顏色發(fā)生顯著變化,。通常它們在約 45°的入射角范圍內(nèi)操作。對于在垂直入射下操作的干涉濾光片,，變化可以忽略不計(jì),。
3
梯度干涉濾光片：
具有與均勻干涉濾光片相同的特性,，但顏色響應(yīng)沿一個(gè)空間方向變化,。因此,，透過率依賴于入射角和在梯度方向上的位置。對于掃描顯微鏡來說,，這種解決方案似乎是最糟糕的,，因?yàn)樵诠馐娜魏挝恢脪呙钑r(shí),，光譜特性都會發(fā)生變化。
因此問題出現(xiàn)了：是否有辦法在非掃描光束路徑中使用梯度濾光片進(jìn)行多通道檢測,，盡管存在所有這些顏色效應(yīng),？
問題 + 問題 = 解決方案
如果我們將梯度濾光片放置在與場共軛的平面中，那么由于變化的位置我們將會有顏色變化,。在與瞳孔共軛的平面中,，由于變化的角度我們將會有顏色變化。
但是,，如果我們將濾光器放在一個(gè)合適的位置（圖 3 中的位置 G）,，并且如果我們合理設(shè)計(jì)濾光器涂層，那么我們可以使這兩種效果相互抵消 [2],。光束路徑和濾光器的設(shè)計(jì)計(jì)算有些繁瑣,，但最終會得到一個(gè)實(shí)用的解決方案。這些結(jié)果是通過徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測器實(shí)現(xiàn)的,。
圖 5：4Tune 光譜非掃描檢測：樣品的發(fā)射（E）通過一組連續(xù)可變的二色分光器（VDS）在空間上分離成子光譜。最終信號分?jǐn)?shù)可以通過連續(xù)可變的帶通濾波器（VBF）進(jìn)行微調(diào),，然后由傳感器 1,、2、3 和 4 接收,。
徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測器采用上述技術(shù),。SP8 DIVE 中集成了梯度二色鏡和濾光片，提供四個(gè)可自由獨(dú)立調(diào)諧的光譜通道,，用于多光子顯微鏡中的非掃描檢測,。用戶可以在直觀且整齊排列的圖形軟件界面中輕松定義所需的波段。該界面允許用戶在熒光中設(shè)置光譜波段,，以獲得最佳效率和通道分離,。它還允許在更改照明波長時(shí)無縫調(diào)諧第二或第三諧波的檢測，同時(shí)進(jìn)行熒光記錄,。
圖 6： 使用 4Tune 探測器的多光子顯微鏡拍攝的鼠皮膚切片圖像,。Lgr5CreERT2-GFP 彩色斑點(diǎn)小鼠的小腸?；疑篠HG 信號（膠原蛋白 1）,，綠色：Lgr5+干細(xì)胞,。紅色、藍(lán)色和黃色,，追蹤的細(xì)胞是 Lgr5 干細(xì)胞的后代,。樣本由荷蘭烏特勒支的 Jacco van Rheenen 提供。
參考文獻(xiàn)：
1.Engelhardt J: Device for the selection and detection of at least two spectral regions in a beam of light. World Patent WO 1995007447 A1, priority Sep. 8th (1993).
2.Gugel H, Neugart F and B?hm I: Scanning Microscope. World Patent WO 2016 / 198694 A1, priority June 11th (2015)
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