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實驗材料：
1.cDNA樣本：通過上游反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA,。
2.熒光定量試劑：Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox),。
3.其他試劑：RNase-free H2O、相關(guān)基因上下游引物(儲存濃度10 μM)。
4.設(shè)備與耗材：移液器,、qPCR儀、冰盒,、離心機,、RNase-free八連排、RNase-free離心管,。
實驗步驟：
試劑&樣本前期準備
試劑解凍和混勻
從冰箱中取出：
從-20℃冰箱中取出含酶試劑,，立即放入冰盒中（冰上操作）；
避免將試劑直接放在室溫下解凍,，以免溫度波動影響酶的活性,。
緩慢解凍：
讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘,；
如果需要快速解凍,，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱,。
輕輕顛倒混勻：
解凍后,，將試劑管輕輕上下顛倒幾次，使試劑充分混勻,；
避免劇烈震蕩或渦旋混勻,，以免破壞酶的活性。
低速離心：
將試劑管短暫離心（5-10秒,，1000 rpm左右）,，使管壁和管蓋上的液體集中到管底；
離心后再次輕輕混勻,，確保試劑均勻分布,；
混勻后的試劑應(yīng)繼續(xù)放在冰上，避免長時間暴露在室溫下,。
Tips：混勻時盡量避免產(chǎn)生氣泡,，氣泡可能會影響酶的活性或?qū)嶒灲Y(jié)果的準確性。
模板稀釋(若需要)
稀釋步驟
若需追蹤模板,，按以下步驟稀釋：
取1 μL 10×Dilution Buffer + 9 μL無菌超純水 → 配制1×Dilution Buffer,；
用1×Dilution Buffer稀釋cDNA至目標濃度（建議稀釋至Ct值20-30的范圍內(nèi)）。
若無需追蹤模板,，直接用無菌超純水稀釋cDNA或者直接使用cDNA原液,。
熒光定量PCR反應(yīng)體系配制
常見的熒光定量儀器為96孔反應(yīng)，大體分為12列×8行。舉例說明：
備注說明：
相對定量分析基因表達情況時,，為排除樣本和操作的影響，對數(shù)據(jù)進行歸一化,，需要有內(nèi)參基因,，例如GAPDH、β-actin等等,。
技術(shù)重復(fù)通常建議設(shè)置3孔,，為保證后續(xù)取平均值或剔除異常值。當然根據(jù)自己的需求進行調(diào)整,，設(shè)置2孔重復(fù)或者4孔重復(fù)均可,。
依據(jù)MIQE準則，NTC(陰性對照)建議設(shè)置,，一方面用于污染風(fēng)險判斷,，另一方面其也是一套實時熒光定量 PCR (qPCR) 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)報告實踐指南以及與發(fā)文共享實驗信息的標準。
熒光定量PCR體系（大體系配制減少誤差）
以上述投入2μL cDNA模板檢測不同樣本基因1為例：
將上述溶液依次加好后，將管蓋蓋嚴,，用手輕彈管壁,，使各組分充分混勻，再放入小型離心機,，短暫離心1-2s,，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上,。
備注：如使用顯蹤劑建議模板投入體積控制在2-5 μL,，以保證顯蹤效果，如使用cDNA母液建議投入體積控制在2 μL(反應(yīng)體系的1/10)以內(nèi)防止影響擴增效果,。
按照上機儀器選取對應(yīng)耗材（八聯(lián)排或96孔板）,。
在對應(yīng)耗材中按照布板依次分裝18μL/孔步驟1)配置的大體系Mix。
在每個孔中加入2 μL對應(yīng)模板,。
移液槍加樣Tips(吸一排二)：
吸取液體：緩慢,、平穩(wěn)地按下按鈕至第一檔(不是按到底)，然后將吸頭浸入液面下,，然后緩慢,、平穩(wěn)地松開檔位至原位來吸取液體。注意不要讓吸頭接觸到容器的邊緣或底部，以防止污染,。
液體排出：將吸頭對準接收容器,，然后緩慢、平穩(wěn)地按下按鈕至第二檔(按到底)以排出液體,。確保所有的液體都被排出,。
完成加樣后,，將管蓋蓋嚴,，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻,，再放入小型離心機,，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡）,，瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）確保無氣泡后置于潔凈的96孔PCR管架,。
備注：注意觀察每一槍是否吸到了氣泡,，若出現(xiàn)氣泡吸取則會導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大偏差,。
熒光定量PCR上機運行
上機前，仔細檢查管子,，確保正上方管蓋,、管身沒有記號筆染料，管內(nèi)無氣泡,、管壁無液體,。
若采用常規(guī)程序，則進行以下設(shè)置：
備注：
不同熒光定量qPCR試劑核心的酶和Buffer組成都存在差異,，對應(yīng)說明書上的程序是該產(chǎn)品大多數(shù)情況下的最適反應(yīng)條件，建議按照說明書的程序進行儀器設(shè)置,，減少因用其他程序帶來的數(shù)據(jù)偏差,；
熔解曲線程序可選用儀器默認程序。
備注：以ABI Q5常規(guī)程序為例,，在進行程序設(shè)置時，確保在退火/延伸階段和熔解曲線的升溫階段打開數(shù)據(jù)信號收集開關(guān),。
若采用快速程序,，需確認儀器本身是否可以快速升降溫，運行快速程序,。以下以ABI Q5為例：
結(jié)果判定
觀察熔解曲線峰是否單一,。
初步判斷復(fù)孔間Ct值差距是否＜0.5，或者進一步計算復(fù)孔間CT值STD是否＜0.2,。
內(nèi)參基因Ct值盡量在14-25之內(nèi),，不要過小也不要過大。
數(shù)據(jù)分析
下機得到的Excel數(shù)據(jù)處理如下：
圖示說明：
④：對照組校正后的數(shù)值,；
③/④：每個小組校正后的數(shù)值比上對照組校正后的數(shù)值；
意圖表上的數(shù)據(jù)在excel中采用了保留2位小數(shù)的形式,，實際計算時不可忽略小數(shù)點后的所有數(shù)字,，減少按數(shù)字的動作，活用Excel,。
注意事項
1,、引物設(shè)計好壞對于最終實驗的成功和實驗結(jié)果都會有一定的影響，可參考干貨軟文,，解鎖更多引物設(shè)計寶藏,。
2、長時間放置的引物,，建議嘗試先用預(yù)實驗(跟著其他實驗或人帶上幾孔測測看),，避免直接進行大規(guī)模正式實驗，從而造成不必要的風(fēng)險損失,。
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