“本文探討了微反應(yīng)器在脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）制備中的應(yīng)用,，重點(diǎn)研究了混合時(shí)間,、顆粒形態(tài)及其對mRNA遞送效率的影響,。通過優(yōu)化混合條件,，在T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器中均成功制備了具有相似尺寸,、mRNA包封效率和空載LNP比例的mRNA負(fù)載LNPs,。值得注意的是,，兩種微反應(yīng)器制備的LNPs在泡狀結(jié)構(gòu)（bleb）的比例上存在顯著差異。T型微反應(yīng)器產(chǎn)生了更高比例的泡狀LNPs,，與mRNA完整性略有增強(qiáng)相關(guān),，而環(huán)形微反應(yīng)器主要形成球形LNPs。體內(nèi)外研究表明,，球形和小尺寸的LNPs展現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率,，而泡狀LNPs在體內(nèi)維持了更長的mRNA表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)和優(yōu)化針對特定治療和開發(fā)需求的微反應(yīng)器提供了有價(jià)值的見解,。”
示意圖
結(jié)果與討論
1.1 LNP的制備與表征：
實(shí)驗(yàn)采用兩種不同類型的微反應(yīng)器——T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器,，來制備mRNA負(fù)載的LNPs,。首先，將含有mRNA的水溶液（檸檬酸鈉緩沖液，pH=4）與基于乙醇的脂質(zhì)溶液分別通過注射泵注入微反應(yīng)器中,。在微反應(yīng)器內(nèi)部,，這兩種溶液迅速混合,，形成LNPs,。通過優(yōu)化操作條件，如總流速和流速比，實(shí)現(xiàn)了對LNP尺寸,、形態(tài)和mRNA包封效率的有效控制,。為了對制備的LNP進(jìn)行表征，采用了多種技術(shù)手段,。通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量了LNPs的粒徑分布,，結(jié)果顯示，在快速混合條件下,，兩種微反應(yīng)器均能夠制備出尺寸較小且分布均勻的LNPs,。此外，還利用低溫透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）對LNPs的形態(tài)進(jìn)行了觀察,。Cryo-TEM圖像清晰地展示了LNPs的球形結(jié)構(gòu),，以及在部分LNP表面存在的泡狀結(jié)構(gòu)（bleb）。
圖一,、混合結(jié)構(gòu)示意圖,，A-環(huán)型，B-T型
圖二,、不同混合結(jié)構(gòu)在不同混合條件下的混合效率評價(jià)
1.2 混合時(shí)間對LNP形成的影響：
混合時(shí)間是影響LNP形成的關(guān)鍵因素之一,。為了評估混合時(shí)間對LNP制備過程的影響，計(jì)算了Damk?hler數(shù)（Da）,，它表示混合時(shí)間（t_m）與特征聚集時(shí)間（t_agg）的比值,。當(dāng)Da<1時(shí)，表明處于快速混合狀態(tài),，此時(shí)混合過程對納米顆粒的形成影響較小,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，在兩種微反應(yīng)器中,，隨著總流速的增加，Damk?hler數(shù)逐漸減小,，最終趨于穩(wěn)定,，說明混合性能足以滿足LNP制備的需求。通過比較兩種微反應(yīng)器的微混合時(shí)間（t_m）與雷諾數(shù)（Re）的關(guān)系,，發(fā)現(xiàn)T型微反應(yīng)器在較高的雷諾數(shù)下表現(xiàn)出更高的混合效率,。這表明，在快速混合區(qū)域操作時(shí),，T型微反應(yīng)器能夠更有效地實(shí)現(xiàn)兩種溶液的均勻混合,，從而有利于形成更小、更均勻的LNPs,。
圖三,、不同混合結(jié)構(gòu)在不同流速條件下制備得到的LNP的理化性質(zhì)評價(jià)
1.3 LNP的形態(tài)與結(jié)構(gòu)：
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，兩種微反應(yīng)器制備的LNPs在形態(tài)上存在顯著差異。具體而言,，環(huán)形微反應(yīng)器制備的LNPs中泡狀結(jié)構(gòu)更為普遍,，而T型微反應(yīng)器制備的LNPs則相對更光滑、球形度更高,。這種形態(tài)上的差異可能與微反應(yīng)器的幾何結(jié)構(gòu)以及混合過程中的流體動(dòng)力學(xué)效應(yīng)有關(guān),。為了揭示LNP形成過程中的機(jī)制，對制備過程進(jìn)行了詳細(xì)的考察,。結(jié)果表明,，在微反應(yīng)器中，mRNA水溶液與乙醇基脂質(zhì)溶液迅速混合后,，形成了初步的LNP核,。隨后，在稀釋過程中,，脂質(zhì)和mRNA進(jìn)一步遷移,，最終形成了具有泡狀結(jié)構(gòu)的LNPs。這一發(fā)現(xiàn)為理解LNP的形態(tài)演變提供了重要線索,。
圖五、不同混合結(jié)構(gòu)制備的LNP的結(jié)構(gòu)表征
1.4 mRNA遞送效率：
為了評估不同特性LNPs的mRNA遞送效率,，選擇了四種具有代表性的LNPs進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,，盡管這些LNPs在制備條件,、微通道幾何形狀等方面存在差異，但它們的mRNA包封效率卻相近,。然而,，在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)T型微反應(yīng)器制備的LNPs（LNP-T）被HepG2細(xì)胞攝取的速度較慢于環(huán)形微反應(yīng)器制備的LNPs（LNP-R）,。這一結(jié)果表明,，LNP的形態(tài)結(jié)構(gòu)可能影響其細(xì)胞攝取效率。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),，LNP-R具有更高的球形度和更少的泡狀結(jié)構(gòu),，這可能使其更容易被細(xì)胞識別和攝取。此外,，LNP-R還表現(xiàn)出更高的體外轉(zhuǎn)染效率,，特別是在低劑量下。這些結(jié)果提示我們,，通過優(yōu)化LNP的形態(tài)結(jié)構(gòu),，可以進(jìn)一步提高其mRNA遞送效率。
圖八,、不同樣品的體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)表征
結(jié)論
本研究系統(tǒng)地探討了T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器中mRNA負(fù)載LNPs的制備過程,，并評估了混合時(shí)間、顆粒形態(tài)對mRNA遞送效率的影響,。結(jié)果表明,，通過優(yōu)化微反應(yīng)器設(shè)計(jì)、操作條件和配方選擇,，可以優(yōu)化mRNA遞送系統(tǒng),，實(shí)現(xiàn)快速起效與持續(xù)表達(dá)的平衡，為特定治療應(yīng)用提供有力支持,。未來研究將進(jìn)一步探索LNP結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)性能之間的精確關(guān)系,，以及如何通過微反應(yīng)器技術(shù)實(shí)現(xiàn)更精確的控制和優(yōu)化。
參考文獻(xiàn)：Chen, D., Liu, Z., Guo, L., et al. (2025). Controlled preparation of lipid nanoparticles in microreactors: Mixing time, morphology and mRNA delivery. Chemical Engineering Journal, 505, 159318. [DOI: 10.1016/j.cej.2025.159318]
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