上期我們簡(jiǎn)單介紹了一下動(dòng)物細(xì)胞核懸液制備試劑盒，這期我們?cè)敿?xì)介紹一下具體使用步驟吧,。

一,、材料

1.組織處理工具:手術(shù)剪、手術(shù)刀,、鑷子等

2.儀器:水平離心機(jī),、組織研磨儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,。

3.試劑:RNase 抑制劑,、BSA.

4.耗材:含有鋯珠的研管、低吸附槍頭,、5mL和15mL離心管,、40μm(和10μm)細(xì)胞篩.

二、動(dòng)物細(xì)胞核懸液制備試劑盒使用方法

準(zhǔn)備工作:

1,、切取組織約 200mg(黃豆粒大小)

2,、裂解液、前懸液和后懸液需要添加 BSA,，終濃度 1%,，根據(jù)樣本所需試劑體積現(xiàn)用現(xiàn)配。細(xì)胞核 RNA 相關(guān)實(shí)驗(yàn),，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有試劑都需要加RNase抑制劑(終濃度1U/L),，根據(jù)樣本所需試劑體積現(xiàn)用現(xiàn)配,。如:每1mL溶液需要加40 U/uL的RNase 抑制劑25 μL.

三、動(dòng)物細(xì)胞核懸液制備試劑盒操作步驟:

1.使用移液器吸取1mL 裂解液,，緩慢注入含有鋯珠的研磨管中

2.迅速將細(xì)胞樣本,、新鮮組織或冰凍組織樣本轉(zhuǎn)移至上述裝有裂解液和鋯珠的研磨管內(nèi)勇盡可能使組織塊細(xì)小均勻，如圖2

3.使用組織研磨儀研磨至無(wú)明顯組織大塊，使組織呈均勻的勻漿狀，如圖3.將研磨好的樣本靜置2~3min(時(shí)間不要超過(guò)3min),，將樣本緩慢倒入40um 細(xì)胞篩中進(jìn)行過(guò)濾，使用15m離心管收集濾液5.使用1~3mL前懸液沖洗研磨管和細(xì)胞篩,，確保殘留在其中的細(xì)胞和組織碎片被充分沖洗下來(lái)，并將沖洗液一并收集到第4步裝有濾液的15m離心管中,。

6.使用水平離心機(jī),，4℃,，500xg,，離心5min，棄上清.

7.使用前懸液重懸沉淀至300L,，加入等體積(300μ)的PB1,，用移液器吹打混勻。將混合后的600液轉(zhuǎn)移至一新的5m離心管中,。8.吸取 600LPB2,將槍頭緩慢插人離心管最底層,，輕柔緩慢加入PB2,使溶液自然分層,避免擾動(dòng)下層溶液

9.吸取600μLPB3,將槍頭緩慢插到離心管最底層，輕柔緩慢加人PB3,，使溶液再次分層操作過(guò)程中要保持手部穩(wěn)定,，控制加入液體的速度，如圖4.

10.務(wù)必使用水平離心機(jī),，并設(shè)置為居中的加速度和減速度,，4°C，3000xg,，離心20 min.11.離心后,，緩慢取出離心管。溶液分成3層,。核層位于PB2和PB3溶液交界處,，移除上方碎片層(約1000L)，去除碎片層后吸取核層(約400L液體)于新的離心管中,，如圖4 和圖 5.

12.加人5倍體積(約2mL)的后懸液,，吹打混勻。

13.使用水平離心機(jī),，4℃,，700xg離心5min，棄上清

14.根據(jù)所需的細(xì)胞核濃度，使用約50~2mL的后懸液將沉淀重懸,。若需要較高的細(xì)胞核濃度,，可選擇較小體積的后懸液;若需要較低濃度，則選擇較大體積的后懸液15.觀察計(jì)數(shù)儀明場(chǎng),，若存在大于細(xì)胞核的碎片且細(xì)胞核量足夠,可在保持細(xì)胞核懸液較高濃度的情況下,，再經(jīng)10μm 細(xì)胞篩去除雜質(zhì)。若背景干凈,，無(wú)明顯雜質(zhì),，則可跳過(guò)此步驟16.質(zhì)控結(jié)束后應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。