小鼠皮質(zhì)醇（Cortisol）ELISA檢測(cè)試劑盒的正確使用方法

信帆生物供應(yīng)各類ELISA試劑盒,，提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù),，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,，庫存充足,。

【檢驗(yàn)原理】

試劑盒采用酶聯(lián)免疫分析方法,。采用生物素標(biāo)記Cortisol,，純化的抗Cortisol抗體包被微孔板,，在競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)中,，一定量的固相抗體與生物素標(biāo)記Cortisol及非標(biāo)記抗原（校準(zhǔn)品或標(biāo)本）進(jìn)行抑制競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),，抗體與生物素標(biāo)記的Cortisol結(jié)合量受非標(biāo)記抗原量所抑制，非標(biāo)記抗原量多,抗體與生物素標(biāo)記的Cortisol結(jié)合就少,，反之結(jié)合就多,；反應(yīng)平衡后，形成固相抗體-生物素化Cortisol,，再加入酶標(biāo)記的親和素,，形成固相抗體-生物素化Cortisol-酶標(biāo)-親合素復(fù)合物。經(jīng)加底物顯色后,，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,。隨著Cortisol濃度的升高，OD值逐漸下降呈良好的線性關(guān)系。本試劑盒具有靈敏度高,、特異性強(qiáng),、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單,、快速等特點(diǎn),，對(duì)血清中Cortisol的減少或升高有可靠的檢出性能。

【主要組成成分】

主要成分

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：12,、6,、3、1.5,、0.75,、0 ng/mL本品必須按照具有潛在的感染性進(jìn)行處理，處理過程應(yīng)當(dāng)遵循通用的安全措施,。

需要但未提供的材料及耗材

 1,、酶標(biāo)儀

2、精密移液器及一次性吸頭

3,、蒸餾水

4,、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6,、500ml量筒

7,、無粉一次性乳膠手套

【儲(chǔ)存條件及有效期】

 1、2-8℃保存,，切勿冷凍,，有效期6個(gè)月。

 2,、開封使用后,，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋,，并將全部試劑放回2-8℃冰箱,。

 3、開封后,，按照建議的條件保存,，校準(zhǔn)品、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體,，有效期為14天,，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

 半自動(dòng)的酶標(biāo)儀,，如Thermo MK3,，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

 樣本類型和采集

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中,，不得使用疊氮鈉做為防腐劑,。

1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min,，去除細(xì)胞顆粒和聚合物,，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融,。

2,、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，4000rpm條件下離心20min,，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

3,、血漿：肝素,，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

4、組織：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測(cè),。

樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下,，可以儲(chǔ)存72h，或者在- 20℃儲(chǔ)存6個(gè)月。樣本收集后,，不是一次檢測(cè)完,，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融,，使用時(shí)在室溫下解凍,，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗(yàn)方法】

試劑準(zhǔn)備

1,、使用前,，所有的組分都要至少復(fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫,。

2,、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解,。濃縮洗滌液與蒸餾水,，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液,，添加19份的蒸餾水,。

操作程序

1.      將各種試劑移至室溫平衡兩小時(shí)，取濃縮洗滌液,，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量,，用蒸餾水1：20稀釋，混勻后備用,。

2.      將預(yù)包被板從密封袋中取出,，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，不加任何液體,；每個(gè)校準(zhǔn)品設(shè)2孔,，每孔加入對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)品50μl；其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加待測(cè)血清或質(zhì)控品50μl,。

3.      除空白孔外所有孔加入生物素化抗原50μl,，混勻，貼上封板膜,，置37℃溫育60分鐘,。

4.      手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔,，靜置10秒甩干,，重復(fù)3次后拍干,。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

5.      每孔加入酶標(biāo)親合素50μl（空白對(duì)照孔除外）,，混勻,，貼上封板膜，置37℃溫育30分鐘,。

6.      手工洗板：棄去孔內(nèi)液體,，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干,，重復(fù)3次后拍干,。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

7.      每孔加顯色劑A 50μl,，顯色劑B 50μl,，振蕩混勻后，置37℃避光顯色15分鐘,，每孔加終止液50μl,。

8.      用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm,，先用空白對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn),，然后測(cè)定各孔光密度值（OD值）。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算】

檢測(cè)完成后,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋,，通過上述方法測(cè)的的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度,。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1,、僅供科研使用，不得用于臨床診斷,。

2,、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用,。

3,、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用,。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。

5,、如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后,，再重新測(cè)定,。

6、通過其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果,，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

1.  外觀和物理檢查:試劑盒應(yīng)組分齊全，內(nèi)外包裝均應(yīng)完整,，標(biāo)簽清晰,，液體試劑無滲漏。各組分裝量不少于表1中要求,。

2.  線性: 用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，在0.375 ng/mL – 12 ng/mL范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)不低于0.9900,。

3.  精密度

3.1分析內(nèi)精密度:試劑盒質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）應(yīng)不大于15.0%,。

3.2批間精密度:在三個(gè)不同批次產(chǎn)品之間，質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）應(yīng)不大于15.0%

4.  低檢出限:低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL,。

5.       質(zhì)控品測(cè)定值: 每次檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)在允許范圍內(nèi),。

【注意事項(xiàng)】

生物安全

1、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定,，嚴(yán)格防止交叉污染,，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置,。

2,、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑,，可能引起皮膚過敏反應(yīng),，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3,、底物液對(duì)皮膚,、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧,。戴上防護(hù)手套,，實(shí)驗(yàn)完成后洗手。

技術(shù)提示

1,、混合蛋白溶液時(shí),，避免起泡,。

2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染,。

3,、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟,，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件,。

4、底物溶液為無色液體,，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色,，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用,。

5,、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后,，藍(lán)色底物產(chǎn)物,，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。

6,、實(shí)驗(yàn)中,，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。

7、所有液體組分,，使用前充分搖勻,，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作,。

廢物處理

 所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料,，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序,，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有責(zé)任根據(jù)其實(shí)驗(yàn)的類型和危險(xiǎn)性級(jí)別，進(jìn)行廢物和污物的處理,，同時(shí)要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對(duì)待所有的廢物和污物,。

免責(zé)聲明

1.  試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn),，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行操作,，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),。

小鼠皮質(zhì)醇（Cortisol）ELISA檢測(cè)試劑盒的正確使用方法