年終總結(jié)

能工巧匠,，必善用其器,。Lonza旗下的電穿孔核轉(zhuǎn)染技術(shù)(Nucleofection™)無疑是細(xì)胞轉(zhuǎn)染的利器,。

電穿孔核轉(zhuǎn)染是一種升級(jí)版的轉(zhuǎn)染技術(shù),，它克服傳統(tǒng)電穿孔方法在轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力方面的限制,。Nucleofector™通過優(yōu)化電場和脈沖條件,，提高了難以轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,，并在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達(dá)以及基因編輯和細(xì)胞治療等多種應(yīng)用和各個(gè)領(lǐng)域中展現(xiàn)出良好的前景,。

ONE

巧思妙用,，解鎖科研新思路

1·基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞，為骨骼再生提供可能

2020年,，哈薩克斯坦努爾蘇丹納扎爾巴耶夫大學(xué)阿斯塔納國家實(shí)驗(yàn)室生命科學(xué)中心的Sholpan Askarova團(tuán)隊(duì)在Regenerative Medicine上發(fā)表了題為"Mesenchymal stem cells modifications for enhanced bone targeting and bone regeneration"的綜述性文章,，系統(tǒng)了闡述了包括電轉(zhuǎn)染(Electroporation)在內(nèi)的細(xì)胞編輯技術(shù)，對(duì) “改造” 間充質(zhì)干細(xì)胞,，提高其促進(jìn)骨骼修復(fù)的能力,，讓骨骼再生成為可能【1】。

2·核轉(zhuǎn)染人類造血干細(xì)胞,，助力干細(xì)胞移植療法

造血干細(xì)胞(Hematopoietic Progenitor Cells: HPC)是多種疾病治療過程中自體和異體的細(xì)胞移植的供體,，遺傳標(biāo)記HPC并進(jìn)行后續(xù)的命運(yùn)追蹤是干細(xì)胞領(lǐng)域一項(xiàng)重要的研究方法,。2006年，德國烏爾姆醫(yī)學(xué)部Jan Torzewski團(tuán)隊(duì)在Future Medicine上發(fā)表了題為"Efficient transient genetic labeling of human CD34+ progenitor cells for in vivo application"的研究性文章【2】,。該研究通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)染(nucleofection)技術(shù)在不同譜系的造血干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了截短的低親和力神經(jīng)生長因子受體(ΔLNGFR),，篩選出Mutz2細(xì)胞可能作為人類髓系HPC的體外模型。該研究所描述的方法在Nucleofector™的助力下,，已適應(yīng)于良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)標(biāo)準(zhǔn),，并已準(zhǔn)備好用于體內(nèi)應(yīng)用。在此過程中,，Nucleofector™重要作用不可忽視,，它不僅提高了遺傳標(biāo)記的效率，還確保了細(xì)胞的正常分化能力,，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了可靠的基礎(chǔ),。

3·瘤治療新思路，CRISPR編輯DNA甲基化修飾

2020年,，伊朗加茲溫醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科學(xué)系的Mehdi Azad團(tuán)隊(duì)在Future Medicine上發(fā)表了題為"CRISPR-mediated modification of DNA methylation pattern in the new era of cancer Therapy"的綜述性文章【3】,。該文章總結(jié)了DNA甲基化對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，同時(shí)匯總了如何運(yùn)用不同的CRISPR-Cas9系統(tǒng)來進(jìn)行基因編輯,，表觀修飾和染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)控,。那么，Nucleofector™結(jié)合不同的CRISPR轉(zhuǎn)染體系無疑是實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因編輯,，表觀修飾編輯,，和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)控的強(qiáng)大工具，是實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的重要手段,。

4·電轉(zhuǎn)CRISPR與Flow Cytometry有效結(jié)合,，解鎖免疫細(xì)胞療法

與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 是最為廣泛應(yīng)用的手段,。Flow Cytometry則是長維度篩選鑒定基因編輯后免疫細(xì)胞,，包括淋巴細(xì)胞，表面標(biāo)記物,、性質(zhì),、功能的重要方法。2022年,，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院生物系統(tǒng)和生物材料部Lili Ma團(tuán)隊(duì)在BioTechniQue上發(fā)表了題為"Evaluation protocol for CRISPR/Cas9-mediated CD19 knockout GM24385 cells by flow cytometry and Sanger sequencing",，的研究方法型論文【4】。該研究詳細(xì)的描述了如何利用4D-Nucleofector™ (AAF-1003B; Lonza, NJ, USA)和SF Cell Line Kit (V4XC-2032 or V4XC-2012; Lonza)成功轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9-gRNA到類成淋巴細(xì)胞系GM24385中,；接著通過Flow Cytometry鑒定CD19 敲除后GM24385的細(xì)胞特性,，為安全，高效的細(xì)胞基因編輯和免疫療法提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

TWO

不斷升級(jí),，不斷優(yōu)化的

Nucleofector™轉(zhuǎn)染體系

近期,，Lonza團(tuán)隊(duì)成功優(yōu)化了人源肝臟原代細(xì)胞(Primary Human Hepatocyte: PHH)的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染條件，實(shí)現(xiàn)了高效,、低毒性的PHH轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染后的PHH能良好的維持細(xì)胞特性、功能,。人源肝原代細(xì)胞維持部分肝細(xì)胞功能,，用于模擬肝臟響應(yīng)藥物處理和藥毒性檢測的重要細(xì)胞模型，但PHH難轉(zhuǎn)染,，細(xì)胞敏感易退化的特性嚴(yán)重限制了其在科研和藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用,。而Lonza團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了的培養(yǎng)和優(yōu)化條件則突破了這些障礙，再高效轉(zhuǎn)染后的第7天,，PHH仍然維持著良好的細(xì)胞特性,。這些無疑為更好的在科研和藥物篩選過程中使用PHH提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

▲ Efficient Transfection and Sustained Long Term Functionality of Primary Human Hepatocytes

此外,，Lonza團(tuán)隊(duì)用全新升級(jí)的4D-Nucleofector™系統(tǒng)成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)型的Cas9 T細(xì)胞,，為基礎(chǔ)研究提供了強(qiáng)大的篩選平臺(tái)，更為CAR-T細(xì)胞療法提供的堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀顯示,，無論是敲除(Knock-out)還是過表達(dá)(Knock-in)，有了Nucleofector™轉(zhuǎn)染技術(shù)的加持,，都實(shí)現(xiàn)了高效,、穩(wěn)定的基因編輯。

▲ Inducible Cas9 T Cells: An Innovative Platform for Allogenic CAR-T Cell Generation

THREE

專家視角

Theodore Roth

Resident, Stanford Pathology;

Co-Founder, Arsenal

Biosciences

(CA, USA)

斯坦福大學(xué)生理學(xué)醫(yī)師,，Arsenal Biosciences 的聯(lián)合創(chuàng)始人Theodore Roth (MD, Ph. D),，是電穿孔核轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的資深專家。Theo在加州大學(xué)舊金山分校修MD-Ph. D學(xué)位時(shí),，便成功借助了電穿孔核轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合混合敲入技術(shù),，在人原代免疫細(xì)胞中進(jìn)行大規(guī)模的基因編輯。Theo指出他們利用了96-well Nucleofector™轉(zhuǎn)染系統(tǒng),，進(jìn)行了混合基因編輯和單個(gè)基因中高通量的編輯的多個(gè)實(shí)驗(yàn),，回答了其課題中所提出的多個(gè)科學(xué)問題。正是這種電核轉(zhuǎn)染中高通量技術(shù)的出現(xiàn)和使用,，讓藥物靶點(diǎn)篩選更為便捷，更為高效,。

今年9月,，Lonza的電穿孔核轉(zhuǎn)染技術(shù)更是助力Arsenal Bioscience實(shí)現(xiàn)了實(shí)體瘤CAR-T細(xì)胞療法的設(shè)計(jì)，助力其贏得了今年細(xì)胞療法領(lǐng)域大的私募融資。Arsenal Biosciences的核心技術(shù)是非病毒載體的基因編輯CITE技術(shù)(CRISPR Integration of Transgenes by Electroporation),，即利用 Lonza的電穿孔核轉(zhuǎn)染手段實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因CRISPR整合技術(shù),，使T細(xì)胞有選擇的靶向腫瘤，從而使得患者的免疫系統(tǒng)在不破壞正常組織的情況下摧毀腫瘤細(xì)胞,。

▲ Arsenal Bioscience CITE programming via Nucleofector

無論是領(lǐng)域內(nèi)的專家視角,，還是Nucleofector™在各種細(xì)胞類型、各種遞送物質(zhì),、各種科研方向的實(shí)際應(yīng)用,，以及對(duì)CAR-T細(xì)胞基因編輯等臨床治療方面的技術(shù)支撐都切實(shí)的呈現(xiàn)了Lonza Nucleofector™平臺(tái)的強(qiáng)大實(shí)力和對(duì)科研領(lǐng)域、藥物篩選,、細(xì)胞療法的助力,。

與此同時(shí)，Lonza的專家團(tuán)隊(duì)和全體工作人員,，不斷探索,、優(yōu)化、升級(jí),，更是為廣大科研工作者和藥物開發(fā)者提供了越來越完善,、完備的方案和體系，讓大家真正的實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染的高效無憂,。