細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境的分界線,，而膜蛋白（MPs）作為細(xì)胞的基本組成成分,，介導(dǎo)許多關(guān)鍵過(guò)程,，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、成分傳輸,、酶反應(yīng),、細(xì)胞之間的通信等。在生命科學(xué)領(lǐng)域,，研究膜蛋白對(duì)于理解細(xì)胞功能,、疾病機(jī)制及藥物開發(fā)具有重要意義。膜蛋白的表達(dá)與純化一直是研究中的難點(diǎn),，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu),、疏水性,、低表達(dá)量、易形成包涵體以及潛在的毒性使得傳統(tǒng)表達(dá)方法面臨諸多挑戰(zhàn),。而無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（ CFPS）的興起,，為膜蛋白研究帶來(lái)了革命性的變革。

膜蛋白作為一類特殊的蛋白質(zhì),，其表達(dá)與純化過(guò)程尤為復(fù)雜。除了常見的問(wèn)題外（比如：膜蛋白定位,、跨膜蛋白疏水性,、蛋白毒性、表達(dá)水平低等）,，還有以下一些挑戰(zhàn)：

稀有密碼子：部分膜蛋白基因含有稀有密碼子,，這些密碼子不能被宿主細(xì)胞識(shí)別，導(dǎo)致多肽鏈合成不完-全,，從而不能形成功能性膜蛋白,。

易形成多聚體：膜蛋白在熱變性過(guò)程中容易形成多聚體，導(dǎo)致抗體無(wú)法識(shí)別或條帶分子量發(fā)生變化或扭曲,，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

提取方法復(fù)雜：由于膜蛋白與膜結(jié)合緊密，不易從膜上洗滌下來(lái),，特別是跨膜蛋白,，具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域，提取分離困難,。目前常用的提取方法包括超速離心,、密度梯度離心等，但每種方法都有其局限性,。

檢測(cè)難度大：膜蛋白在樣品中的表達(dá)量通常不高,，在總蛋白中占比較低，用總蛋白檢測(cè)時(shí),，目標(biāo)蛋白含量可能低于檢測(cè)下限,，無(wú)法檢測(cè)到。此外,，膜蛋白的western Blot實(shí)驗(yàn)也面臨諸多挑戰(zhàn),，如條帶不清晰、分子量不對(duì)或條帶扭曲等,。

對(duì)于體外結(jié)構(gòu)研究來(lái)說(shuō)（如X射線衍射、核磁共振光譜或交聯(lián)方法等）CFPS已經(jīng)成為一個(gè)日益重要的研究領(lǐng)域,，并且它在其他領(lǐng)域也有很高的潛力,，包括工業(yè)蛋白質(zhì)生產(chǎn)等,。一般來(lái)說(shuō)，CFPS可以在不使用完整活細(xì)胞的情況下進(jìn)行體外蛋白的合成,，只需要合成系統(tǒng)中包含核糖體和氨基酰tRNA合成酶等核心蛋白質(zhì)表達(dá)機(jī)制的細(xì)胞提取物,，同時(shí)提供能量恢復(fù)系統(tǒng)、氨基酸,、NTP,、tRNA和DNA等必需的前體即可。與重組蛋白生產(chǎn)相比,，它有以下幾個(gè)主要優(yōu)勢(shì)：

• CFPS可以表達(dá)對(duì)細(xì)胞有損害的蛋白質(zhì)或肽，包括膜整合蛋白,、疫苗等,；

• CFPS系統(tǒng)允許通過(guò)不同的策略有效地納入非天然氨基酸（NSAA）；

• CFPS的蛋白純化過(guò)程可簡(jiǎn)化為一兩個(gè)親和力純化步驟,，表達(dá)后的提取物也可以直接應(yīng)用于下游工作,；

• CFPS過(guò)程中免去了許多耗時(shí)和關(guān)鍵的步驟（比如細(xì)胞培養(yǎng)）；

• CFPS允許在開放系統(tǒng)中直接解決降解,、錯(cuò)誤靶向或不溶性表達(dá)等問(wèn)題,，允許獨(dú)立于細(xì)胞活力或生長(zhǎng)的情況下優(yōu)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

圖1:無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)合成膜蛋白的實(shí)驗(yàn)方案

CFPS系統(tǒng)是膜蛋白合成的一種新的核心平臺(tái),。其在人工疏水環(huán)境中的表達(dá)允許膜蛋白的共翻譯溶解和折疊，如納米膜或膠束,。在沒有疏水化合物的情況下,，合成的膜蛋白可定量沉淀，同時(shí)仍然可以保留很大一部分折疊的結(jié)構(gòu)元素,。即使是復(fù)雜的膜蛋白（比如大型轉(zhuǎn)運(yùn)體）,，也可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)合成大量此類沉淀物。沉淀物可以在洗滌劑中溶解或重組成膜,，以進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)或功能分析,。

我們知道,，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，是人類基因組中最大的膜蛋白群體,，大約35%的商業(yè)藥物是針對(duì)這些蛋白質(zhì),。對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究的先決條件是制備以毫克蛋白質(zhì)為單位的高度濃縮、穩(wěn)定且具有生物活性的樣本,。傳統(tǒng)的表達(dá)方法會(huì)存在很多問(wèn)題,，而CFPS可以規(guī)避這些問(wèn)題?；谄溟_放性,，允許研究人員向系統(tǒng)中添加物質(zhì)。這促進(jìn)了蛋白表達(dá)和溶解,，允許快速篩選出最佳表達(dá)條件,。

此外，膜基納米顆粒（如脂質(zhì)體,、聚合物和脂質(zhì)納米顆粒）的表面改性,，以及靶向分子（如結(jié)合蛋白）的修飾是治療材料設(shè)計(jì)的重要一步。然而,，這種修飾可能既昂貴又耗時(shí),，需要細(xì)胞宿主進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，將會(huì)花費(fèi)漫長(zhǎng)的純化和共軛時(shí)間來(lái)將蛋白質(zhì)附著在納米載體表面,，這最終限制了有效蛋白質(zhì)共軛納米載體的發(fā)展,。目前，已有研究使用CFPS系統(tǒng)來(lái)快速創(chuàng)建蛋白質(zhì)共軛膜基納米載體,。使用這種方法,，多種類型的功能結(jié)合蛋白，包括affibodies,、scFvs等,，都可以通過(guò)無(wú)細(xì)胞表達(dá)，并在一個(gè)鍋中結(jié)合到脂質(zhì)體上,。此外,，可以進(jìn)一步擴(kuò)展到其他納米顆粒，包括聚合物和脂質(zhì)納米顆粒,，適用于多種共軛策略,，包括表面附著以及集成到納米顆粒膜中。利用這些方法,，證明了雙特異性人工抗原呈遞細(xì)胞的快速設(shè)計(jì),，并增強(qiáng)了脂質(zhì)納米顆粒貨物的體外輸送。預(yù)計(jì)這種工作流程將能夠快速生成基于膜的輸送系統(tǒng)，并增強(qiáng)我們創(chuàng)建細(xì)胞模仿療法的能力,。

圖3：膜基納米顆粒的快速合成

1. Schmidt P, Bender BJ, Kaiser A, et al. Improved in Vitro Folding of the Y2 G Protein-Coupled Receptor into Bicelles. Front Mol Biosci. 2018;4:100. Published 2018 Jan 17. doi:10.3389/fmolb.2017.00100.

2. Goncharuk MV, Vasileva EV, Ananiev EA, et al. Facade-Based Bicelles as a New Tool for Production of Active Membrane Proteins in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023;24(19):14864. Published 2023 Oct 3. doi:10.3390/ijms241914864.

3. Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006.

4. Peruzzi JA, Vu TQ, Gunnels TF, Kamat NP. Rapid Generation of Therapeutic Nanoparticles Using Cell-Free Expression Systems. Small Methods. 2023;7(12):e2201718. doi:10.1002/smtd.202201718.