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實時熒光定量PCR儀主要由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成。熒光定量系統(tǒng)負責監(jiān)測PCR反應過程中的熒光信號,，而計算機則負責收集,、處理和分析這些熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示,，原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表，便于后續(xù)的分析和解讀。
其工作原理基于在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光標記探針,。這些熒光物質(zhì)能夠隨著PCR反應的進行而發(fā)出熒光信號,，其強度與擴增產(chǎn)物數(shù)量成正比。在PCR反應過程中,，儀器通過熒光檢測系統(tǒng)實時測量熒光信號強度,，從而監(jiān)測PCR擴增的進程。
具體來說,，PCR反應包括變性,、退火和延伸三個步驟。在變性步驟中,，DNA雙鏈被打開成單鏈,；在退火步驟中，特異性引物與模板DNA的單鏈結(jié)合,；在延伸步驟中,，DNA聚合酶沿著引物延伸，合成新的DNA鏈,。這三個步驟在PCR儀中通過準確控制溫度來實現(xiàn)循環(huán)進行,，每個循環(huán)擴增的產(chǎn)物量呈指數(shù)增長。
根據(jù)所用熒光物質(zhì)的化學原理和PCR檢測的特異性,，可將實時熒光定量PCR儀分為兩大類：DNA染料法和熒光探針法,。
1.DNA染料法：如SYBR Green I等熒光染料可以快速滲入DNA雙鏈與之結(jié)合，發(fā)射熒光信號,，而不摻入雙鏈的熒光染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,，可以對特異性和非特異性的PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。這種方法可檢測所有雙鏈DNA擴增產(chǎn)物,，包括非特異反應產(chǎn)物,，如引物二聚體，不需要探針,，因此減少了實驗設(shè)計及運轉(zhuǎn)成本,，適合于大量基因的分析，但缺點是易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象,。
2.熒光探針法：可分為Taqman探針法和分子信標探針法,。Taqman探針法是在PCR擴增時在加入一對引物的同時，再加入一個特異性的熒光探針,，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團,。當探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號正好被淬滅基團吸收,，體系中沒有光信號,；隨著反應的進行，探針被Taq酶的5'-3外切酶酶切降解,，使報告基團與淬滅基團分離,，信號檢測系統(tǒng)接收熒光信號,。分子信標是種由于堿基互補形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，由于熒光基團與猝滅基團靠得很近,，熒光被淬滅,。PCR擴增過程中隨著DNA雙鏈解鏈，信標的莖環(huán)與暴露的DNA靶序列雜交,，互補區(qū)被拉開致使熒光基團和泮滅基團之間距離增加,，熒光恢復。
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