PCR由變性–退火–延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;

② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;

③ 引物的延伸：DNA模板–引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

④ 重復(fù)循環(huán)變性–退火–延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行,，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升,。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,，n代表循環(huán)次數(shù),。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值,。

反應(yīng)初期,，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù),、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍?/p>

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間,，是需要擴(kuò)增的特定片段,。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例,，在第一個反應(yīng)周期中,，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸,，其5’端是固定的,，3’端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一,，這就是“長產(chǎn)物片段”,。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外,，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合,。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的,，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn),，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”,。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計,，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

試劑

DNA模板,，與特定DNA模板結(jié)合的引物,，去離子水，商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液,，dNTP, MgSO4（可選）和DMSO（可選）

PCR反應(yīng)開始前的準(zhǔn)備工作

PCR反應(yīng)開始前,，你需要準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或者反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設(shè)計或利用軟件設(shè)計）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據(jù)實驗的目的不同做出決定）。

1. DNA聚合酶的選擇,。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇,，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇自己實驗需要的產(chǎn)品,。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶,。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應(yīng)當(dāng)選擇高保真聚合酶,。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否,，那普通的Taq聚合酶已經(jīng)足夠。另外要注意的一點(diǎn)是,，進(jìn)行T載體連接的時候,，要了解高保真的聚合酶所得的產(chǎn)物是沒有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進(jìn)行加A反應(yīng),?；蛘咧苯舆x用普通的Taq聚合酶。

2. 引物,。引物特異性會影響到PCR反應(yīng)成功的可能性，好的引物設(shè)計對PCR成功至關(guān)重要。設(shè)計引物時,，有以下幾條原則需要謹(jǐn)慎考慮：

1. 引物長度,。通常PCR引物長度在18-22個堿基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠,。

2. 解鏈溫度Tm,。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間,。

3. GC含量,。GC含量為40-60%。

就目前而言很多軟件都可以用來設(shè)計引物,，如primer5和Oligo,。通常這些軟件設(shè)計得到的引物均可以滿足需要。

步驟

準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀,，就可以開始PCR實驗：將各種試劑混合并按照說明書設(shè)置PCR反應(yīng),。一般PCR循環(huán)如下：

1. 起始步驟：這對于熱啟動PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶,。這一步的時間取決于所選用的DNA聚合酶,。

2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合,。在這一步,，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA,。這是PCR循環(huán)中的第一步。

3. 退火步驟：變性之后,，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在,。因為反應(yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時,，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵,。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度,。這一步通常維持20-40秒,，而聚合酶會結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。

4. 延伸步驟：在這一步,，DNA聚合酶開始DNA合成,，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的溫度。通常我們選用72度,，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度,。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力,。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA,。

5. 第2步至第4步稱為一個循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個循環(huán),。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長,，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降,，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制,。

6. 最后的延伸步驟：當(dāng)30-35個循環(huán)結(jié)束后，我們通常會以68-74度延伸5-10分鐘,，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢,。

7. 維持時間：通常我們設(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。